Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte I

Questo mini-dossier nasce come risposta a tutti coloro che chiedono “se non sperimentiamo sugli animali, cosa dovremmo fare?”

Sappiamo benissimo che un singolo metodo non può sostituire un organismo intero, ma il modello animale, anche se è un organismo intero, ci fornisce dati irrilevanti. Un insieme di tecniche basate su dati specie-specifici ci fornisce dati rilevanti per l’umano, e, sebbene non costituiscano un organismo completo, utilizzati in maniera integrata possono avvicinarsi alla complessità umana molto meglio dell’animale [1,2,3,4].

Non faremo distinzione tra metodi validati e non validati, dato che l’attuale metodo di validazione prevede il confronto con i dati forniti dall’animale – che non è predittivo – il che non ci permette di valutare la reale efficacia di una o più metodologie integrate.

In questo senso, criticando il modello animale quale gold standard, bisogna per forza di cose criticare un metodo di validazione che si basa su di esso.
Non a caso, nella sostituzione del Draize Test, c’è stata necessità di rieffettuare una validazione, non per colpa dei metodi sostitutivi, ma per i falsi positivi che il Draize test tendeva a dare [5].

Infatti il Cytosensor Microphysiometer, che doveva rimpiazzare il Draize Test, diede un risultato inizialmente inconcludente, dato che si confrontò il suo risultato con quello del Draize test stesso, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive [6].

Infine, vogliamo avvisare i lettori che questo è l’adattamento di un dossier LAV del 2007 (http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf), pertanto non è aggiornato e non è quindi esaustivo.

Riferimenti:

[1] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Cell Tissue Bank. 2011 Feb;12(1):31-2. doi: 10.1007/s10561-010-9213-5. Epub 2010 Sep 8.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20824349

[2] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Altern Lab Anim. 2010 Dec;38 Suppl 1:27-30.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21275480

[3] Hillier C, Bunton D. Could fresh human tissues play a key role in drug development? Altern Lab Anim. 2009 Sep;37 Suppl 1:5-10.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19807198

[4] Hillier C, Bunton D. Functional human tissue assays. Drug Discov Today. 2007 May;12(9-10):382-8. Epub 2007 Apr 5. 
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17467574

[5] Alan M. Goldberg, Thomas Hartung, “Protecting more than animals”, Scientific American, January 2006

[6] Hartung T, Bruner L, Curren R, Eskes C, Goldberg A, McNamee P, Scott L, Zuang V. First alternative method validated by a retrospective weight-of-evidence approach to replace the Draize eye test for the identification of non-irritant substances for a defined applicability domain. ALTEX. 2010;27(1):43-51. 
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20390238

 

TOSSICITA’ ACUTA:

Il progetto sulla tossicità acuta “ACuteTox”, conclusosi nel 2010, prevede il ricorso a metodi in vitro e lo studio di tutti i dati già disponibili in natura sulla tossicità acuta.*

Inoltre, sarebbe teoricamente possibile beneficiare di tutti i dati già disponibili custoditi ad esempio in centri antiveleni, ospedali e industrie, che hanno il vantaggio di offrire dati sulla tossicità umana. Su questi dati è ipotizzabile effettuare uno studio con metodi QSAR e screening in vitro con i saggi già in uso su colture cellulari.

* Riferimenti:

C. Clemedson, B. Blaauboer, J. Castell, R. Clothier, S. Coecke, T. Cole, A. Forsby, M. J. Gómez- Lechón, A. Kinsner-Ovaskainen, J. E. O’ Connor, M. P. Ryan, M. Sjöström and J. A. Vericat. Overview of the ACuteTox project and multivariate analysis of the in vitro data. VII World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. Roma (Italy), August 30- September 3, 2009. Oral presentation. ALTEX, 26 (Spec. Issue) 1-376 (2009) pp 269.

Kopp-Schneider A. Statistical analysis of the ACuteTox data: challenges and statistical approaches. VII World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. Roma (Italy), August 30- September 3, 2009. Oral presentation. ALTEX, 26 (Spec. Issue) 1-376 (2009) pp 269-270.

 

FULL TEXT: http://www.altex.ch/resources/theme3.pdf

IRRITAZIONE OCULARE*

– Uno studio accurato della sostanza da un punto di vista chimico fisico consente di effettuare una prima scrematura. Ad esempio, sostanze con pH altamente acido o altamente alcalino sono sicuramente irritanti e quindi non dovrebbero necessitare di alcun altro test;

– Analisi statistica dei dati già disponibili in letteratura per verificare se sono disponibili dati di una sostanza strutturalmente simile che potrebbe presentare effetti analoghi, valutabili con metodi QSAR

– Modelli di cornea umana in vitro:

1) saggio EpiOcular** (prodotto da MatTek, USA): è costituito da cellule di epidermide umana cresciuta su un terreno privo di derivati animali, su particolari supporti in modo che si formi una struttura multistrato che simula l’anatomia dell’epitelio della cornea. Il test consiste nel misurare, con appositi saggi, il grado di danneggiamento delle cellule da parte della sostanza in esame. È utile per misurare gradi di irritazione da leggeri a moderati, mentre non è predittivo per sostanze a sospetto alto potere irritante. Già utilizzato da alcune industrie.

2) modello HCE*** (prodotto da SkinEthic, Francia): si tratta di una ricostruzione di epitelio di cornea umana ricostituito in vitro a partire da cellule fatte crescere su un substrato di policarbonato. Già in uso da alcune industrie.

3) Modello HCE – T (prodotto da Gillette Corporation, USA): è un modello costituito da cellule di epitelio di cornea umana fatte crescere su un substrato di collagene. È stato validato da ECVAM; è utilizzabile solo per certe tipologie di liquidi.

4) Metodo IRRITECTION****: è un modello in vitro integrato con un software, utilizzabile anche per il test di irritazione cutanea. La struttura base di questo modello è una proteina di grandi dimensioni, che insieme ad altri componenti forma una matrice trasparente simile alla cornea umana. L’azione irritante di una sostanza ha l’effetto di opacizzare la struttura e l’opacizzazione viene misurata: maggiore è l’opacizzazione, maggiore è il potere irritante.

 Riferimenti:

* Alternative (non Animal) Methods for Cosmetics Testing: Current Status and Future Prospects. Edited by C. Eskes e V. Zuang; ATLA, Vol. 33, luglio 2005.
FULL TEXT: http://www.frame.org.uk/atla_issue.php?iss_id=15

** Stern M, Klausner M, Alvarado R, Renskers K, Dickens M. Evaluation of the EpiOcular((TM)) Tissue Model as an Alternative to the Draize Eye Irritation Test. Toxicol In Vitro. 1998 Aug;12(4):455-61.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20654428

*** Cotovio J, Grandidier MH, Lelièvre D, Bremond C, Amsellem C, Maloug S, Ovigne JM, Loisel-Joubert S, Lee AV, Minondo AM, Capallere C, Bertino B, Alépée N, Tinois-Tessonneaud E, de Fraissinette Ade B, Meunier JR, Leclaire J. In vitro assessment of eye irritancy using the Reconstructed Human Corneal Epithelial SkinEthic HCE model: application to 435 substances from consumer products industry.

Toxicol In Vitro. 2010 Mar;24(2):523-3
7. doi: 10.1016/j.tiv.2009.11.010. Epub 2009 Nov 12.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19913609

**** http://www.invitrointl.com/products/irritect.htm

IRRITAZIONE CUTANEA

– Irritection test (vedi Irritazione Cutanea)

– EpiDerm*

– EpiSKIN*

Riferimenti:
* Faller C, Bracher M, Dami N, Roguet R. Predictive ability of reconstructed human epidermis equivalents for the assessment of skin irritation of cosmetics. Toxicol In Vitro. 2002 Oct;16(5):557-72.

CORROSIONE CUTANEA

Questo saggio viene eseguito per valutare la capacità corrosive di una sostanza sulla pelle; per eseguire questo test sono oggi disponibili tre kit commerciali di pelle ricostituita in sostituzione degli animali.

– Epiderm* consiste in frammenti di tessuto epidermico che devono essere conservati in frigorifero prima dell’uso; i pezzi vengono trattati con la sostanza da testare ed in seguito si misura il livello di corrosione attraverso la misura della riduzione dell’attività di un enzima vitale.

– Episkin** è un modello tridimensionale di pelle umana compreso di strato corneo; il funzionamento è analogo al metodo Epiderm.

– Corrositex* è una matrice di collagene ricostituito su cui viene posta la sostanza da testare; l’effetto viene misurato osservando la variazione di un colorante. Maggiore è il tempo necessario perché si verifichi la reazione, minore è l’effetto corrosivo della sostanza

Riferimenti:

* Wilson, D.M., McMullin, T.T. Kan, H.L., Golden, R.M. Stott, W.T. Dow Chemical, Midland, MI, USA. COMPARISON OF CORROSITEX AND EPIDERM™ IN VITRO SKIN CORROSION SCREENING ASSAYS TO IN VIVO CORROSIVITY RESULTS. Society of Toxicology 46th Annual Meeting, Charlotte, NC, (2007). The Toxicologist, 96, 1, 144 (2007).
(http://www.toxicology.org/AI/PUB/Tox/2007Tox.pdf)

** Netzlaff F, Lehr CM, Wertz PW, Schaefer UF. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm: an evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 2005 Jul;60(2):167-78.

SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA

– Modello informatico DEREK*, già utilizzato da molte industrie. Tali modelli consentono di predire la reazione immunitaria sulla base delle caratteristiche strutturali della sostanza da testare.

– Strategia integrata: test su linfociti umani coltivati in vitro seguita da valutazione su pelle umana ricostituita in vitro. Sono state coltivate diverse cellule della pelle umana che hanno un ruolo nella riposta immunitaria.

– Test su volontari: molto diffuso è il ricorso al cosiddetto “patch test”, che consiste nell’applicare sulla pelle di volontari un cerotto contenente la sostanza in esame per periodi di tempo e frequenze di applicazioni variabili.
Patch test utilizzati: Schwartz – Peck Test**; Human Repeated Insult Patch Tests (HRIPTs)***, Human Maximisation test (HMT)****.

– Test su espianti di pelle: sono stati condotti test su espianti di pelle umana (materiale di scarto proveniente da interventi chirurgici).

Riferimenti:

* Barratt MD, Langowski JJ. Validation and subsequent development of the DEREK skin sensitization rulebase by analysis of the BgVV list of contact allergens. J Chem Inf Comput Sci. 1999 Mar-Apr;39(2):294-8.

** Schwartz L (1951) The skin testing of new chemicals. J Soc Cosmet Chem 2:321-4.

Schwartz L (1969) Twenty-two years’ experience in the performance of 200,000 prophetic patch tests. South Med J 53:478-84.

Schwartz L, Peck SM (1944) The patch test in contact dermatitis. Public Health Rep 59: 546-57.

*** Draize JH, Woodard G, Calvery HD (1944) Methods for the study of irritation and toxicology of substances applied topically to the skin and mucous membrane. J Pharmacol Exp Ther 83: 377-90.

Draize JH (1959) Dermal toxicity. Appraisal of the safety of chemicals in foods, drugs and cosmetics. Association of food and drug officials of the United States, Texas State Department of Health. Texas: Austin.

Shelanski HA (1951) Experience with and considerations of the human patch test method. J Soc Cosmet Chem 2:324-31.

Shelanski HA, Shelanski WV (1953) A new technique of human patch tests. Proc Sci Sekt Toilet Goods Assoc 19:46-9.

**** Kligman AM (1966) The identification of contact allergens by human assay. III. The Maximisation Test: a procedure for screening and rating contact sensitisers. J Invest Dermatol 47:393-409.

(Ulteriori informazioni: http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety/opinions/sccnfp_opinions_97_04/sccp_out102_en.htm )

ASSORBIMENTO CUTANEO

Questo test viene eseguito su campioni di pelle (il protocollo di questo test è indicato nelle linea guida OECD 428, che consiglia l’uso di pelle suina o umana) su cui viene posta la sostanza da testare e di cui si valuta l’assorbimento valutando il passaggio della sostanza dalla camera superiore a quella inferiore (figura). Il tempo di esposizione può variare a seconda che la sostanza sia destinata a permanere a contatto con la pelle (creme) o ad essere sciacquata via (saponi).

FOTOTOSSICITÀ

Questo test mira a valutare i possibili effetti di una sostanza chimica sulla pelle nel momento in cui essa è esposta alle radiazioni solari, come accade ad esempio per creme per il viso, ma soprattutto creme e stick per labbra solari. Oggi sono disponibili test in vitro che eliminano il ricorso ad animali, molto simili al test di assorbimento cutaneo (vedi sopra), al quale si unisce però l’osservazione degli effetti in seguito ad esposizione a raggi UV:

– 3T3 NRU Phototoxicity (96-well cell-based assay)*

– 3-D Reconstructed Human Epidermis Phototoxicity**

Il primo può essere usato per testare gli ingredienti, il secondo è usato per testare le formulazioni in un modello di esposizione della pelle.

Riferimenti:

* Ceridono M, Tellner P, Bauer D, Barroso J, Alépée N, Corvi R, De Smedt A, Fellows MD, Gibbs NK, Heisler E, Jacobs A, Jirova D, Jones D, Kandárová H, Kasper P, Akunda JK, Krul C, Learn D, Liebsch M, Lynch AM, Muster W, Nakamura K, Nash JF, Pfannenbecker U, Phillips G, Robles C, Rogiers V, Van De Water F, Liminga UW, Vohr HW, Wattrelos O, Woods J, Zuang V, Kreysa J, Wilcox P. The 3T3 neutral red uptake phototoxicity test: practical experience and implications for phototoxicity testing–the report of an ECVAM-EFPIA workshop. Regul Toxicol Pharmacol. 2012 Aug;63(3):480-8. doi: 10.1016/j.yrtph.2012.06.001. Epub 2012 Jun 9.

** http://www.iivs.org/scientific-services/laboratory-services/phototoxicity/3-d-phototoxicity/

TOSSICITÀ SUBACUTA E SUBCRONICA

Gli studi di tossicità cronica servono a predire scenari di esposizione ad una sostanza per tempi
lunghi. È il caso, ad esempio, di additivi alimentari, che possono essere ingeriti quotidianamente in piccole quantità. È necessario investigare gli effetti della sostanza a livello di quegli organi in cui è probabile che la sostanza man mano si accumuli e svolga i suoi effetti: fegato, reni, sistema nervoso centrale, polmoni e midollo.

Per soddisfare richieste così complesse è auspicabile il ricorso a sistemi integrati di metodi in vitro e in silico (modelli QSAR):

– Modello QSAR TOPKAT (http://accelrys.com/mini/toxicology/predictive-functionality.html), realizzato proprio per studiare il metabolismo di sostanze chimiche. È già in uso sebbene non possa essere impiegato ai fini legislativi perchè non ancora ufficialmente validato.

– Test in vitro: i saggi in questi test devono poter essere mantenuti per diversi giorni, difficoltà che limita il ricorso all’impiego di colture cellulari. Sono in corso diversi studi volti ad individuare le linee cellulari più adatte allo scopo. A seconda dell’organo bersaglio sono disponibili:

• fegato: esistono difficoltà tecniche al mantenimento per lunghi periodi di cellule epatiche umane, unitamente alla difficoltà di reperirle. Alcune linee cellulari di fegato umano consentono di eseguire test utili per studiare la tossicità ripetuta di una sostanza; buoni risultati sono stati ottenuti con la coltivazione di cellule epatiche insieme a collagene*

• reni: sebbene laboriosi esistono modelli di strutture renali umane che garantiscono buoni risultati**;

• sistema nervoso centrale: cellule di neuroblastoma umano sono state utilizzate per predire la tossicità subcronica a livello nervoso (ma possono essere utilizzate anche cellule cerebrali umane, dato che le fettine di tessuto cerebrale umano ottenute da autopsia entro 8 ore dopo la morte possono essere mantenute in vitro per estesi periodi – anche 78 giorni – e possono essere manipolate sperimentalmente***);

• polmoni: è disponibile il modello EpiAirway della Mattek (http://www.mattek.com/pages/products/epiairway), costituito da cellule dell’epitelio della trachea e dei bronchi umani che formano una struttura multistrato, utile anche per studi di ricerca su asma, fibrosi cistica e altro;

• midollo: sono state messe a punto colture di cellule umane di vario tipo su un supporto costituito da tessuto di midollo spinale, in grado di sopravvivere dalle 8 alle 12 settimane****.

I metodi appena elencati non sono ancora stati oggetto di studi di validazione, pertanto, sebbene scientificamente attendibili e tecnicamente praticabili non sono utilizzabili ai fini legislativi.

Riferimenti:
* Salman R Khetani & Sangeeta N Bhatia. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology 26, 120 – 126 (2008)
ABSTRACT: http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n1/abs/nbt1361.html

**Felder E, Jennings P, Seppi T, Pfaller W. LLC-PK(1) cells maintained in a new perfusion cell culture system exhibit an improved oxidative metabolism. Cell Physiol Biochem. 2002;12(2-3):153-62.

*** Verwer RW, Hermens WT, Dijkhuizen P, ter Brake O, Baker RE, Salehi A, Sluiter AA, Kok MJ, Muller LJ, Verhaagen J, Swaab DF. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB J. 2002 Jan;16(1):54-60.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11772936

FULL TEXT: http://www.fasebj.org/content/16/1/54.full.pdf

**** Questa coltura di cellule è chiamata LTBMC, dall’inglese long term bone marrow culture (cultura del midollo spinale a lungo termine). Oltre a queste esistono le LTC-Ics (Long Term Culture Initiating cells) e le ML-IC (Myeloid-lymphoid initiating cell), che servono a valutare gli effetti di una sostanza sulla proliferazione delle cellule del midollo ed altre (vedi In: Alternative (non Animal) Methods for Cosmetics Testing: Current Status and Future Prospects. Edited by C. Eskes e V. Zuang; ATLA, Vol. 33, luglio 2005 [http://www.frame.org.uk/atla_issue.php?iss_id=15]).

MUTAGENICITÀ/GENOTOSSICITÀ

Uno studio di mutagenesi, così come altri studi di tossicità, non può prescindere dalla rigorosa caratterizzazione chimica della molecola facendo anche ricorso ai dati esistenti in letteratura su sostanze simili. Successivamente si eseguono i molti test in vitro disponibili:

– Metodi in silico

– Test dell’aberrazione cromosomica di mammifero: serve a valutare il potere di causare deformazioni nella struttura dei cromosomi di cellule di mammifero coltivate in vitro; per la sua esecuzione si possono utilizzare cellule del sangue umano (in particolare linfociti). È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di Ames: consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni su geni singoli. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia. viene eseguito su cellule batteriche coltivate in vitro*. Le prerogative di questo test, tuttora ampiamente utilizzato, sono: il basso costo, la riproducibilità, la semplicità di esecuzione, la rapidità. Sulla base del test di Ames sono stati messi a punto altri tipi di saggi.

– Saggio di mutazione genica in lievito: questo test utilizza cellule di lievito alimentare e consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni su geni singoli. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di ricombinazione mitotica in lievito: questo test utilizza cellule di lievito alimentare e serve a valutare la capacità di una sostanza di indurre scambi di materiale tra sezioni diverse del DNA. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di mutazione genica in cellule di mammifero descritto nella linea guida: per questo saggio si possono impiegare diverse linee cellule, tra cui anche cellule umane; consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni in geni. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di sintesi di imprevista sintesi di DNA: questo test serve ad evidenziare la riparazione del DNA a seguito del danno subito dopo l’esposizione ad un agente chimico. Può essere eseguito su diverse linee cellulari. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Saggio dello scambio dei cromatidi fratelli: questo test serve ad evidenziare scambi di materiale genetico tra cromatidi fratelli a seguito del danno subito dopo l’esposizione ad un agente chimico. Può essere eseguito su diverse linee cellulari. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test in vitro del micronucleo di mammifero: il test utilizza cellule coltivate e serve a valutare cambiamenti strutturali e numerici nei cromosomi; è ampiamente utilizzato in università ed industria ma non ancora formalmente validato (di questo test esiste anche una versione in vivo).

– Saggio in vitro Comet: questo saggio serve a valutare la rottura di frammenti del DNA in cellule coltivate; è ampiamente utilizzato in università ed industria ma non ancora formalmente validato.

Inoltre si sta sviluppando una nuova frontiera: la tossicogenomica, ovvero l’applicazione della genetica in ambito tossicologico, ma al momento non si è giunti ad una fase di validazione formale dei test.

Riferimenti:

* Nella sua versione originale le cellule batteriche venivano coltivate in estratto di cellule di fegato di ratto; recentemente il test è stato migliorato attraverso l’impiego di materiale umano [Use of human liver S9 in the Ames test: assay of three procarcinogens using human S9 derived from multiple donors. Hakura A, et al.; Regul Toxicol Pharmacol. 2003 Feb;37(1):20-7.] (ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12662906) e [An improvement of the Ames test
using a modified human liver S9 preparation. Hakura A, et al.; J Pharmacol Toxicol Methods. 2001 Nov-Dec;46(3):169-72.] (ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12183193)

TOSSICOCINETICA

I test per lo studio della tossicocinetica vengono eseguiti dopo alcuni altri test (tossicità acuta, ripetuta, subcronica, mutagenesi etc), così molte informazioni utili sono già disponibili per avere una indicazione del metabolismo della sostanza. Poiché il percorso di una molecola all’interno di un organismo coinvolge diversi distretti corporei, è necessario utilizzare batterie di test con cellule differenti. Alcuni metodi attualmente disponibili:

1) Attraversamento di barriere biologiche: i due saggi illustrati servono a fornire indicazioni sulla capacità di una molecola di attraversare barriere biologiche. Sono in corso studi per sviluppare modelli di altre barriere, come la placenta e la barriera emato- encefalica, che si trova “all’ingresso” del cervello. Questi sistemi sono già utilizzati dalle industrie farmaceutiche ma non ancora formalmente validati.

Saggi su cellule intestinali e polmonari. Come modello di barriera intestinale sono impiegate le cellule umane Caco – 2 e Caco – 2/TC 7, con cui è possibile valutare il grado di assorbimento di una sostanza a livello intestinale. Come modello di epitelio polmonare è possibile ricorrere a vari sistemi (vedi anche Test di tossicità ripetuta e subcronica); un esempio sono le cellule BEAS – 2B, isolate da epitelio bronchiale umano.

Membrane artificiali: si tratta di sistemi in vitro costituiti da lipidi che riproducono la struttura di una membrana.

2) Distribuzione della sostanza

Stima del livello plasmatico: il test serve a verificare la capacità della sostanza a legarsi a proteine del plasma umano attraverso l’impiego di appositi apparecchi per la filtrazione.

Coefficiente di ripartizione acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva: è un test che consente di valutare la capacità della sostanza di accumularsi nel tessuto adiposo. Il sistema acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva simula il sistema sangue/tessuto adiposo: maggiore è la tendenza della sostanza a ripartirsi in ottanolo oppure olio di oliva, maggiore è la sua tendenza ad accumularsi nel tessuto adiposo.

Saggio di biotrasformazione 1: si allestisce un preparato costituito da omogenato di fegato umano*, enzimi, ormoni e l’agente da testare. Si prelevano campioni del preparato in diversi momenti analizzando la quantità di sostanza presente: il grado di diminuzione della quantità presente è un indice della metabolizzazione della sostanza da parte del fegato. Questo test è diffusamente impiegato in ambito farmaceutico ma non ancora formalmente validato.

Saggio di bioattivazione: anche in questo saggio vengono utilizzate cellule di fegato, questa volta per verificare la trasformazione da parte dell’organismo della sostanza da testare in sostanza potenzialmente dannosa (da qui “bioattivazione”). Si possono eseguire diversi test, ad esempio aggiungendo degli agenti che inibiscono la bioattivazione: se la tossicità diminuisce in presenza degli inibitori significa che gli effetti tossici sono causati effettivamente dalla bioattivazione. Questo saggio è usato in molti laboratori ma non ancora formalmente validato.

Test in silico di biotrasformazione:

Alcuni di questi metodi impiegati insieme costituiscono una efficace strategia integrata, cui già ricorrono diversi laboratori.

Ad esempio: il sistema Cloe screen e il sistema Cloe PK, sviluppati da Cytoprotex PLC, UK, ampiamente usato in ambito farmaceutico; il sistema Simcyp, sviluppato presso l’Università di Sheffield, UK ed utilizzato da molte industrie farmaceutiche da oltre 15 anni. Questi sistemi sfruttano sia modelli come i QSAR sia batterie di saggi in vitro su cellule diverse dell’organismo umano.

Note:

* Frammenti di fegato umano proveniente da materiale di scarto da interventi chirurgici, vengono sminuzzati fino a formare un preparato omogeneo.

CANCEROGENESI

– Metodi in silico: modello CASE*

– Saggio di trasformazione cellulare: serve a verificare la capacità di una sostanza di trasformare una cellula normale in cancerosa. Questo test è condotto in vitro, ma impiega linee cellulari di topo o di embrione di criceto. Queste linee cellulari sono conservate e mantenute in banche di cellule, pertanto non richiedono il nuovo sacrificio di animali, ma purtroppo per la loro preparazione tempo fa sono stati sacrificati animali. Pur essendo disponibili molte linee cellulari umane, non ne è però previsto l’impiego nei saggi ufficiali. 

– Saggio di comunicazione intercellulare: la rapida proliferazione delle cellule cancerose è consentita grazie anche a dei disordini associati alle normali congiunzioni delle cellule nel tessuto sano. Esiste una relazione positiva tra sostanze in grado di inibire giunzioni tra cellule e insorgenza del cancro. Per eseguire questo saggio possono essere impiegate cellule di vario tipo; il test non ha ancora subito validazione formale.

– Knight ed altri** propongono la sostituzione dei test tradizionali con il seguente protocollo, basato su una combinazione di test:

1. Prima dell’esecuzione del test, tutte le informazioni esistenti circa le sostanze da testare dovrebbero essere riunite e riesaminate criticamente, senza preconcetti, per decidere anzitutto se ulteriori sperimentazioni siano scientificamente giustificate e, se sì, quali.

2. Le indagini iniziali dovrebbero comprendere sistemi QSAR computerizzati, colture cellulari o tessutali, e microarray di DNA. I sistemi QSAR dovrebbero essere impiegati per identificare e valutare gli effetti tossici dei radicali oggetto di sperimentazione. I test di analisi in vitro – tra i quali quello di Ames, quello basato sul Saccharomyces, quelli basati sulla coltura cellulare/tessutale umana – dovrebbero essere impiegati massicciamente, per ricercare eventuali prove di citotossicità, mutageneticità, genotossicità e trasformazione cellulare. I test basati sui microarray di DNA, ben scelti e ben eseguiti, dovrebbero essere impiegati per indagare su eventuali mutamenti di espressione genetica.

3. A seguito di queste indagini iniziali, dovrebbero essere selezionati studi di tossicologia umana non invasivi, per ricostruire la tossicocinetica e calcolare le concentrazioni di sostanza negli organi.

Collazionando appropriatamente i dati così ottenuti, è assai probabile ottenere una descrizione delle potenzialità di cancerogenesi umana di una determinata sostanza, con un grado di predittività molto superiore a quella comunemente offerta dai tradizionali test condotti sui roditori.

Riferimenti:

* Richard, A. M. AND C. R. Williams. PUBLIC SOURCES OF MUTAGENICITY AND CARCINOGENICITY DATA: USE IN STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIP MODELS. QSARs of Mutagens and Carcinogens. CRC Press LLC, Boca Raton, FL, , 145-173, (2002).
[http://www.epa.gov/ncct/dsstox/AboutDSSTox/Publications/CRC_QSAR_Richard_Chap5_2003.pdf#search=%22qsar%20case%20carcinogenicity%22]

** Andrew Knight, Jarrod Bailey and Jonathan Balcombe. Animal Carcinogenicity Studies: 3. Alternatives to the Bioassay. ATLA 34, 39–48, 2006

FULL TEXT: http://andrewknight.info/publications/anim_expts_tox/carcino/AK%20et%20al%20Carcino%203%20ATLA%202006%2034(1)%2039-48.pdf

TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE

– È recentemente partito un progetto internazionale denominato ReProtect (http://www.reprotect.eu/).

– Test in vitro su spermatozoi per individuare sia danni al DNA che effetti tossici sulle cellule germinali (da cui hanno origine ovuli o spermatozoi): attualmente condotti su spermatozoi di origine bovina.

– Test in vitro su cellule di Leydig: le cellule di Leydig sono le principali cellule implicate nella produzione ormonale maschile. Sono stati messi a punto test che impiegano cellule di provenienza murina (topo) custodite in banche, per cui non è necessario sacrificare altri animali. L’impiego di cellule non umane, solleva comunque problematiche scientifiche, oltre che etiche; d’altra parte biopsie al testicolo umano sono interventi normalmente eseguiti e che potrebbero fornire materiale per una linea cellulare umana, con ovvi vantaggi.

– Test in vitro su cellule del Sertoli: le cellule del Sertoli si trovano nel testicolo ed hanno un ruolo molto importante nello sviluppo degli spermatozoi. Il test è in fase di sviluppo; è possibile da tempo utilizzare cellule del Sertoli umane.

– Test in vitro su cellule ovariche: analogamente ai test eseguiti su cellule del testicolo, lo stesso dicasi per l’ovaio.

– Effetti sul feto: presso l’Università di Rochester vengono eseguiti studi di tossicità su placenta umana per verificare, ad esempio, la capacità di una sostanza di attraversare la placenta. L’utilizzo diffuso di placenta umana rappresenterebbe un grande vantaggio non solo sotto l’aspetto etico e scientifico per le ragione già esposte, ma anche economico, trattandosi di un materiale di scarto.

– Embriotossicità: Al momento sono stati validati tre test di tossicità su embrioni, di cui però solamente uno sostituisce il ricorso ad animali, sebbene impieghi una linea di cellule di embrione di topo, gli altri ne riducono semplicemente il numero normalmente usato.

– Per studiare la potenzialità di una sostanza come distruttore endocrino esistono test in vitro che forniscono una misura della capacità della sostanza di legarsi ai recettori cui normalmente si legano gli ormoni sessuali sulla superficie delle cellule per espletare le loro funzioni. Esiste una “versione” femminile e una maschile, ovvero una specifica per estrogeni ed una per androgeni.

– Modelli in silico: l’Agenzia americana per la Protezione Ambientale (EPA) sta studiando due modelli QSAR, specifici per la tossicità riproduttiva.

ECOTOSSICITÀ

Lo studio degli effetti tossici sull’ambiente prevede già che 16 test su 24 siano effettuati senza il ricorso ad animali: in laboratorio possono essere costruiti modelli di suolo, acque dolci e marine, su cui poter osservare le proprietà biochimiche e fisiche di una sostanza. 

Ad esempio con metodi chimico – analitici è possibile misurare il tempo necessario perchè la sostanza venga degradata ad opera degli agenti atmosferici e/o dei microorganismi;

– per studiare la bioconcentrazione si misura il  coefficiente di ripartizione acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva: è un test di tipo chimico-fisico che consente di valutare la capacità della sostanza di accumularsi nel tessuto adiposo. Il sistema acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva simula il sistema sangue/tessuto adiposo: maggiore è la tendenza della sostanza a ripartirsi in ottanolo oppure olio di oliva (la fase lipofila del sistema), maggiore è la sua tendenza ad accumularsi nel tessuto adiposo.

– Attualmente, la ricerca sta puntando sulla costruzione di modelli matematici come i QSAR: un esempio è il progetto Demetra*, finanziato dall’Unione Europea nell’ambito del quinto Programma

Quadro, che prevede la costruzione di un modello QSAR specifico per la ecotossicità. Il progetto vede impegnati anche partners italiani e si basa sulla raccolta di dati di effetti documentati di inquinanti rilasciati nell’ambiente per la costruzione del modello.

– Accanto agli appena citati metodi chimici e metodi in silico, recentemente sono stati messi a punto anche metodi in vitro come ad esempio saggi su colture di cellule di pesce, in particolare la linea PLHC-1, che deriva dal fegato della specie Poeciliopis lucida, utili in saggi di tossicità acuta e cronica e promettenti anche per studi di tossicità sulla riproduzione**.

– Per studi di bioconcentrazione è in corso la messa a punto di un promettente modello in vitro che consiste nell’adattare a studi di ecotossicità un metodo impiegato anche nella ricerca farmaceutica, chiamato PAMPA. Questo modello prevede l’impiego di una membrana artificiale, simile ad una membrana biologica, posta tra due compartimenti, uno dei quali ospiterà la soluzione contenente la sostanza. Si valuta poi la capacità della sostanza di attraversare la membrana***.

Esiste la possibilità di impiegare metodi in vitro anche in sostituzione dell’uso di lombrichi, così come documentato da uno studio canadese che ha messo a punto un metodo non cruento per ottenere colture cellulari di lombrico da impiegare in studi di ecotossicità****.

Riferimenti:

* http://www.demetra-tox.net/index.php

** Fent K. Permanent fish cell cultures as important tools in ecotoxicology. ALTEX. 2007;24 Spec No:26-8.

FULL TEXT: http://www.forschung3r.ch/data/projects/AltexSupl-07-Fent-Bul9.pdf

*** Escher B, Kwon JH. Development of an in vitro system for modeling bioaccumulation of neutral, ionizable, and metabolically active organic pollutants in fish. ALTEX. 2007;24 Spec No:81-2.

FULL TEXT: http://www.forschung3r.ch/en/projects/pr_100_06.html

**** Hendawi M, Sauvé S, Ashour M, Brousseau P, Fournier M. A new ultrasound protocol for extrusion of coelomocyte cells from the earthworm Eisenia fetida. Ecotoxicol Environ Saf. 2004 Sep;59(1):17-22.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15261718

BIOMATERIALI E DISPOSITIVI MEDICI

Esempio: ambito odontoiatrico

I test in questo ambito includono:

– test sui materiali per quanto riguarda le loro caratteristiche chimico-fisiche e meccaniche
– prove di biocompatibilità (un materiale è biocompatibile quando non induce risposta infiammatoria o immunitaria nell’organismo con cui viene a contatto)

Le proprietà chimico-fisiche e meccaniche dei materiali vengono testate su modelli completamente artificiali o su denti di origine umana, provenienti da estrazioni e conservati appositamente per questo scopo.

Per quanto riguarda invece la biocompatibilità, nella maggior parte dei lavori sperimentali la pratica abituale è quella di impiantare i materiali nel corpo degli animali, e dopo un certo periodo ucciderli per prelevare i loro organi, sezionarli e studiarli al microscopio o con altre tecniche.

Metodi sostitutivi:

Utilizzo di cadaveri o coinvolgimento di pazienti (denti estratti, etc), inoltre:

– metodi  in vitro: cellule e tessuti ricostruiti (su http://www.mattek.com si trovano tessuti prodotti con cellule di origine umana, che riproducono la cute e l’epitelio orale e che si possono usare per test di irritazione cutanea e delle mucose).

Per indurre la riformazione dell’osso viene utilizzato osso di origine animale (deantigenato, cioè privato delle proprietà che lo renderebbero suscettibile di rigetto), ma anche sostituti artificial
i e osso umano da donatore (grazie alle Banche dei Tessuti), o osso dello stesso paziente prelevato da altra sede, e i risultati riscontrati sui pazienti indicano che l’osso autologo (preso cioè dalla stessa persona) dà risultati nettamente superiori a quello eterologo (cioè da animale di specie diversa).

[Adattato da: http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf]

Annunci

Rispondi

Inserisci i tuoi dati qui sotto o clicca su un'icona per effettuare l'accesso:

Logo WordPress.com

Stai commentando usando il tuo account WordPress.com. Chiudi sessione / Modifica )

Foto Twitter

Stai commentando usando il tuo account Twitter. Chiudi sessione / Modifica )

Foto di Facebook

Stai commentando usando il tuo account Facebook. Chiudi sessione / Modifica )

Google+ photo

Stai commentando usando il tuo account Google+. Chiudi sessione / Modifica )

Connessione a %s...