Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte II

SPERIMENTAZIONE SUI FARMACI

– Vedi parte riguardante i “test di tossicità” (http://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/26/mini-dossier-sui-metodi-alternativi-parte-i/)

– Metodi in silico: sono diverse le industrie che di routine impiegano tali metodi per lo studio degli effetti delle sostanze chimiche sulla pelle e per le proprietà cancerogene (Derek, Deductive Estimation of Risk from Existing Knowledge, per mutagenesi, cancerogenesi, sensibilizzazione cutanea; Topkat, Toxicity Prediction by Komputer Assisted Technology, per sensiblizzazione cutanea; CASE, Computer Automated Strucuture Evaluation, per sensiblizzazione cutanea); MultiCASE, META, CASETox e Toxalert per studi di tossicità ed ecotossicità.

Molti altri modelli QSAR sono stati sviluppati specificatamente per la ricerca e sviluppo di farmaci, di seguito alcuni esempi:
– Amedis, UK ha sviluppato un modello per i test di cancerogenesi che offre risultati migliori
dell’AMES test.

– Alla Pennsylvania State University è stato messo a punto un modello di stomaco virtuale che
ricrea elementi come il movimento gastrico, la dissoluzione di compresse, e serve a predire il destino del farmaco nel suo passaggio gastrico.[1]

– Tripos’ Volsurf [2] calcola le proprietà correlate all’ADME basandosi sulle interazioni a livello tridimensionale della molecola ed è stato messo a punto partendo da dati di ADME in vitro.

– CombinatoRx, oggi Zalicus, mette a punto modelli in grado di analizzare l’interazione di più farmaci utilizzati contemporaneamente.

– Compudrug (www.compudrug.com) ha sviluppato diversi sistemi per la ricerca in ambito farmaceutico, biotecnologico: HazardExpert è un sistema di predizione che, usato insieme a
MetabolExpert fornisce informazioni sul metabolismo sia del composto iniziale che dei suoi derivati (metaboliti).

– Test in vitro: vedi la parte I del dossier (esclusi biocompatibilità ed ecotossicità).
Nella ricerca farmaceutica inoltre ci sono metodi più avanzati, sebbene alcuni in fase di sviluppo, come gli organi bioartificiali. La Advanced Tissue Sciences Inc., sfrutta questa tecnologia inserendo cellule umane in un bioreattore, un contenitore con temperatura, umidità e altri fattori uguali a quelli del corpo umano. Anche in Italia viene eseguita questo tipo di ricerca, ad esempio, presso l’università della Calabria e l’Università di Pisa, in cui si studiano rispettivamente modelli bioartificiali di fegato e di intestino umani.

– LION Bioscience utilizza il sistema IDEA (in vitro Determination for the Estimation of ADME). Esso è costituito da un modello statistico che predice la permeabilità intestinale di una molecola; da un secondo modello statistico che predice l’assorbimento a partire da caratteristiche strutturali della molecola e da un modello fisiologico dell’assorbimento orale, basato sull’analisi di dati provenienti da test in vitro, dati clinici e caratteristiche chimiche della molecola [3].

– Farmacogenomica
Oggi, la ricerca farmaceutica è volta sempre di più a disegnare farmaci “su misura”, visto che individui diversi possono rispondere alla somministrazione di un medicinale in modo diverso dato il loro profilo genetico. La scienza che studia le relazioni tra farmaci e genoma è la Farmacogenomica. Questi studi sono possibili grazie all’osservazione clinica unitamente alla ricerca genetica e molecolare umana in relazione all’effetto dei farmaci. Lo sviluppo di questa scienza, analogamente alla Tossicogenomica, porterà alla produzione di farmaci più sicuri [4].
Le tecnologie impiegate nella farmacogenomica sono simili a quelle della tossicogenomica: DNA-chip, chiamato anche DNA-microarray, è un vetrino su cui sono inseriti, in apposite micro nicchie di 200 nanometri di diametro (1 nanometro è pari a un milionesimo di millimetro), circa 500.000 filamenti di DNA.
Il suo funzionamento è basato sulla capacità dei geni attivi di una cellula di legarsi ai loro complementari presenti sul vetrino: in questo modo è possibile analizzare porzioni di DNA e riconoscere quali geni sono attivi nel campione biologico. Questo principio è applicabile sia allo studio dei farmaci sia alla ricerca di base, poiché consente di analizzare in poco tempo grandi porzioni di genoma [5].

– La Biologic Inc, California, produce il Phenotype Microarrays (http://spinoff.nasa.gov/Spinoff2005/hm_2.html), che serve a controllare molte funzioni cellulari in base al farmaco cui vengono esposte.

– Cellule coltivate in microchip: il metodo è stato sviluppato dalla Hurel Corporation (http://www.hurelcorp.com). Esso consiste in un microchip a compartimenti, ognuno dei quali ospita cellule diverse (intestino, fegato, reni, cuore, etc). È un modello del metabolismo del farmaco, i cui studi di validazione hanno dimostrato la sua efficacia nel predire il metabolismo dei farmaci meglio dei test su animali e addirittura di prove cliniche [6].

Studi clinici:
– Prima di effettuare prove su volontari esistono software di simulazione per uno studio clinico preliminare, come quello messo a punto da Pharsight (http://www.pharsight.com/main.php).

– Microdosing: consiste nel somministrare bassissime quantità del farmaco da testare e poi eseguire periodicamente delle analisi su sangue e urine dei volontari sottoposti alla sperimentazione per verificare se, come e dove la sostanza è stata trasformata, espulsa o accumulata e per le sue caratteristiche non presenta rischi di effetti collaterali [7]. La novità del microdosing è che la sostanza viene somministrata a dosi dell’ordine di circa 1000 volte inferiori alla dose che potrebbe causare effetti avversi. Oggi è possibile fare questo grazie alle moderne tecniche di analisi chimiche, che consentono di rintracciare in sangue e urine anche piccolissime quantità della sostanza in esame [8] con tecniche di analisi chimica avanzate come la AMS
(Spettrometria di Massa con Acceleratore). Eventualmente, il percorso del farmaco può essere seguito nell’organismo grazie a tecniche di immagine, come la PET: il farmaco viene “marcato” con atomi radioattivi che possono essere seguiti dal macchinario.

– La società inglese Pharmagene impiega esclusivamente cellule e tessuti umani per la ricerca farmaceutica, convinti che sia l’unico modo per sviluppare farmaci efficaci e sicuri. Di recente si è fusa con Asterand, specializzata nella conservazione e distribuzione di tessuti e cellule umane (http://www.asterand.com/Asterand/).

Riferimenti:
[1] Pal A, Indireshkumar K, Schwizer W, Abrahamsson B, Fried M, Brasseur JG. Gastric flow and mixing studied using computer simulation. Proc Biol Sci. 2004 Dec 22;271(1557):2587-94.

[2] Cianchetta, G.; Mannhold, R.; Cruciani, G.; Baroni, M.; Cecchetti, V. “Chemometric studies on  the bactericidal activity of quinolones via an extended VolSurf approach.” J. Med. Chem. 2004, 47, (12) 3193-3201.

Ecker, G. F.; Noe, C. R. “In silico prediction models for blood-brain barrier permeation.”
Current Medicinal Chemistry. 2004, 11, (12) 1617-1628.

Perioli, L.; Ambrogi, V.; Bernardini, C.; Grandolini, G.; Ricci, M.; Giovagnoli, S.; Rossi, C.
“Potential prodrugs of non-steroidal anti-inflammatory agents for targeted drug delivery to the
CNS.” Eur. J. Med. Chem. 2004, 39, (8) 715-727.

Crivori, P.; Zamora, I.; Speed, B.; Orrenius, C.; Poggesi, I. “Model based on GRID-derived
descriptors for estimating CYP3A4 enzyme stability of potential drug candidates.” J. Comp.-
Aided Mol. Design. 2004, 18, (3) 155-166.

Staerk, D.; Skole, B.; Jorgensen, F. S.; Budnik, B. A.; Ekpe, P.; Jaroszewski, J. W. “Isolation of
a library of aromadendranes from Landolphia dulcis and its characterization using the VolSurf
approach.” J. Nat. Prod. 2004, 67, (5) 799-805.

Hu, G. X.; Zou, J. W.; Jiang, Y. J.; Wang, Y. H.; Yu, Q. S. “Predicting human
intestinal
absorption from three-dimensional molecular structure of drugs.” Acta Pysico-Chimica Sinica.
2004, 20, (5) 512-517.

Jin, H. X.; Hu, G. X.; Wu, T. X.; Shang, Z. C.; Zhou, J. W.; Yu, Q. S. “QSAR study on water
solubility of drugs and VolSurf.” Chinese J. Struct. Chem. 2004, 23, (4) 452-458.

Holm, R.; Hoest, J. “Successful in silico predicting of intestinal lymphatic transfer.” Int. J.
Pharm. 2004, 272, (1-2) 189-193.

Ano, R.; Kimura, Y.; Shima, M.; Matsuno, R.; Ueno, T.; Akamatsu, M. “Relationships between
structure and high-throughput screening permeability of peptide derivatives and related
compounds with artificial membranes: application to prediction of Caco-2 cell permeability.”
Bioorg. Med. Chem. 2004, 12, (1) 257-264.

Menezes, I. R. A.; Lopes, J. C. D.; Montanari, C. A.; Oliva, G.; Pavao, F.; Castilho, M. S.;
Vieira, P. C.; Pupo, M. T. “3D QSAR studies on binding affinities of coumarin natural products
for glycosomal GAPDH of Trypanosoma cruzi.” J. Comp.-Aided Mol. Design. 2003, 17, (5-6)
277-290.

Hu, G. X.; Shang, Z. C.; Zou, J. W.; Li, W. J.; Yu, Q. S. “Conformational analysis and VolSurf
characterization of glutathione molecular umbrella.” Acta Chimica Sinica. 2003, 61, (5) 688-
693.

Clark, D. E.; Grootenhuis, P. D. J. “Predicting passive transport in silico – History, hype, hope.”
Current Topics Med. Chem. 2003, 3, (11) 1193-1203.

Hu, G. X.; Shang, Z. C.; Zou, J. W.; Yang, G. M.; Yu, Q. S. “QSAR study and VolSurf
characterization of human intestinal absorption of drugs.” Chinese J. Chem. 2003, 21, (3) 238-
243.

Zamora, I.; Oprea, T.; Cruciani, G.; Pastor, M.; Ungell, A. L. “Surface descriptors for proteinligand affinity prediction.” J. Med. Chem. 2003, 46, (1) 25-33.

Oprea, T. I.; Zamora, I.; Ungell, A. L. “Pharmacokinetically based mapping device for chemical
space navigation.” J. Combi. Chem. 2002, 4, (4) 258-266.

Ooms, F.; Weber, P.; Carrupt, P. A.; Testa, B. “A simple model to predict blood-brain barrier
permeation from 3D molecular fields.” Biochimica Et Biophysica Acta-Mol. Basis of Disease.
2002, 1587, (2-3) Sp. Iss. SI 118-125.

Cruciani, G.; Pastor, M.; Mannhold, R. “Suitability of molecular descriptors for database mining.
A comparative analysis.” J. Med. Chem. 2002, 45, (13) 2685-2694.

[3] http://www.admemodel.com/

[4] FIORGEN Fondazione Farmacogenomica. Polo Scientifico – 50019 Sesto Fiorentino (Firenze) Via Luigi Sacconi, 6
http://www.fiorgen.net/ricerca.htm

[5] Villeneuve DJ, Parissenti AM. The use of DNA microarrays to investigate the pharmacogenomics of drug response in living systems. Villeneuve DJ, Parissenti AM.

Meloni R, Khalfallah O, Biguet NF. DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacol Res. 2004 Apr;49(4):303-8.

[6] Design and Application of Microfluidic Systems for In Vitro Pharmacokinetic Evaluation of Drug Candidates
TMaguire TM, Novik E, Chao P, Barminko J, Nahmias Y, Yarmush ML and Cheng KC.
Current Drug Metabolism, 2009, 10.

A Microfluidic Hepatic Coculture Platform for Cell-based Drug Metabolism Studies
Novik E, Maguire TJ, Chao P, Cheng KC, Yarmush ML.
Biochem Pharmacol. 2009 Nov 16.

Oxygen-mediated enhancement of primary hepatocyte metabolism, functional polarization, gene expression, and drug clearance.
Kidambi S, Yarmush RS, Novik E, Chao P, Yarmush ML, Nahmias Y.
Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 Sep 15;106(37):15714-9.

Evaluation of a microfluidic based cell culture platform with primary human hepatocytes for the prediction of hepatic clearance in human
P. Chao, T. Maguire, E. Novik, K.-C. Cheng and M.L. Yarmush
Biochem Pharmacol. 2009 May 19.

A novel system for evaluation of drug mixtures for potential efficacy in treating multidrug resistant cancers.
Tatosian DA, Shuler ML
Biotechnol Bioeng. 2009 May 1;103(1):187-98

Real-time fluorescence detection of multiple microscale cell culture analog devices in situ.
Oh TI, et al.
Cytometry A. 2007 Oct;71(10):857-65

Incorporation of 3T3-L1 cells to mimic bioaccumulation in a microscale cell culture analog device for toxicity studies.
Viravaidya K, et al.
Biotechnol Prog. 2004 Mar-Apr;20(2):590-7

An In Vivo-Surrogate Assay Platform for Cell-based Studies
Baxter GT, Freedman RM
American Biotechnology Laboratory, February, 2004

The design and fabrication of three-chamber microscale cell culture analog devices with integrated dissolved oxygen sensors.
Sin A, et al.
Biotechnol Prog. 2004 Jan-Feb;20(1):338-45

Development of a microscale cell culture analog to probe naphthalene toxicity.
Viravaidya K, et al.
Biotechnol Prog. 2004 Jan-Feb;20(1):316-23

[7] European Medicines Agency (2004) Position paper on non-clinical safety studies to support clinical trials with a single microdose. CPMP/SWP/2599/02/Rev1.
(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002720.pdf)

[8] Rowald M. Microdosing and the 3Rs. Publication from National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in research. 2006:1–7. NC3Rs #5.

P. Usha Rani and M. U. R. Naidu. Phase 0 – Microdosing strategy in clinical trials. Indian J Pharmacol. 2008 Nov-Dec; 40(6): 240–242.

SPERIMENTAZIONE SUI VACCINI

Dopo aver isolato ed identificato l’agente patogeno, si procede con i seguenti passaggi:

– sequenziamento del genoma dell’agente patogeno con tecniche di biologia molecolare;

– selezione delle proteine del patogeno con proprietà di stimolazione della risposta immunitaria: per eseguire questo passaggio si impiegano modelli informatici (in silico): analogamente ai modelli QSAR, ci sono modelli in grado di predire il potere immunogeno di una proteina sulla base della conoscenza del potere immunogeno di proteine note *. Oggi ci sono banche che custodiscono le sequenze geniche di centinaia di batteri, funghi e virus patogeni. Alcuni modelli in silico disponibili sono:
EpiMer, EpiMatrix, Conservatrix, BlastiMer, Patent-Blast**, Immunogrid (progetto italiano);

– produzione in vitro delle proteine selezionate;
– test di tossicità: vedi parte I del dossier;

potency test (per verificare l’efficacia del vaccino): si misura con metodi chimico analitici la quantità di antigene presente.
Nel 1997 la Farmacopea Europea non ha richiesto l’esecuzione di test su animali per il potency test su vaccino antidifterite, tetano e pertosse, risparmiando così la vita a 35.000 animali ogni anno. È plausibile che man mano questa decisione verrà estesa anche ad altri vaccini.

Riferimenti:
* Surajit Ray and Thomas B Kepler. Amino acid biophysical properties in the statistical prediction of peptide-MHC class I binding. Immunome Res. 2007; 3: 9.
** De Groot AS, Bosma A, Chinai N, Frost J, Jesdale BM, Gonzalez MA, Martin W, Saint-Aubin C. From genome to vaccine: in silico predictions, ex vivo verification. Vaccine. 2001 Aug 14;19(31):4385-95.

ANALISI SU ALIMENTI E NELLA DIAGNOSI

La tendenza attuale è quella di ricorrere all’analisi chimica. Con la chimica analitica è necessario conoscere la molecola che si intende rintracciare per poi verificarne la presenza e la quantità nel campione.
L’Istituto Zooprofilattico di Lazio e Toscana è un esempio di come, negli ultimi anni si stia sempre di più ricorrendo all’uso di metodi analitici e saggi in vitro per le verifiche igienico sanitarie su alimenti per la diagnosi. Molti dei test prima eseguiti su animali si stanno sostituendo con altre metodiche. Si riporta di seguito il caso esemplificativo delle biotossine algali.

Le biotossine algali sono molecole prodotte da alcune specie di alghe che rivestono interesse sanitario in quanto contaminanti alimentari, in particola
re di molluschi bivalvi (cozze, vongole, etc).
Il Ministero della Salute opera un monitoraggio sui molluschi per rintracciare la presenza di biotossine algali attraverso gli Istituti Zooprofilattici che effettuano analisi per il controllo dell’igiene degli alimenti (Decreto del 16 maggio 2002).
Il test di riferimento indicato per rintracciare la presenza di biotossine in estratti di molluschi prevede l’impiego di topi o ratti. Più spesso viene impiegato il topo, attraverso il saggio MBA (Mouse Bio Assay), che prevede l’impiego di tre topi o tre ratti (in questo caso trattasi di Rat Bio Assay) cui viene iniettato intraperitonealmente (nella cavità addominale) il campione da testare. Si valuta la comparsa di reazione diarrogena o la morte entro un tempo definito; i sintomi osservabili sono comunque vari: prostrazione, ipotermia, tachicardia.
Le tossine sono classificate in 8 gruppi in base alla loro struttura chimica e in tre gruppi in base alla loro attività tossica: PSP (Paralytic Shellfish Poison), ASP (Amnesic Shellfish Poison) e DSP (Diarrhoeic Shellfish Poison). Gli effetti possono spaziare dal mal di testa alla diarrea e persino alla morte.

Metodi sostitutivi:
Per la determinazione delle tossine ASP non si ricorre più all’impiego di animali: a livello internazionale è riconosciuto e accettato il metodo chimico analitico; si continuano invece ad utilizzare animali per rintracciare le tossine PSP e DSP (Capitolo V dell’allegato alla direttiva 91/492/EEC).

Metodi disponibili:
metodi chimico – analitici:
cromatografia liquida ad alto rendimento (HPLC con determinazione fluorimetrica, la cromatografia su strato sottile (TLC)
spettrometria di massa (MS)

metodi biochimici e in vitro:
test di inibizione della fosfatasi
test di citotossicità
immunosaggi (sebbene per eseguire questi siano impiegati anticorpi prodotti utilizzando animali)

Un report dell’Istituto tedesco per la valutazione del rischio (Position Paper Nr. 013/2005 of the BfR of April 07, 2005) riporta che la Germania non ricorre più all’impiego di animali per rintracciare biotossine algali dal 1980, avvalendosi esclusivamente di metodi di analisi chimica. L’analisi chimica è un approccio rigoroso e scientifico rispetto all’impiego di animali poiché fornisce un dato certo della presenza della tossina nei molluschi e della loro quantità. Gli esperti tedeschi dichiarano che il metodo chimico analitico offre affidabilità e sicurezza del metodo, oltre al vantaggio di non comportare sofferenza e uccisione di alcun animale.
Sono disponibili anche metodi in vitro basati su colture cellulari e sistemi che si basano sull’interazione tra tossine e recettori sulla superficie cellulare; oppure si sfrutta l‘effetto delle biotossine di modificare la differenza di potenziale delle membrane cellulari; oppure il loro effetto inibitorio su alcuni enzimi.
Questi sono i metodi in fase di studio per le tossine DSP: studi di prevalidazione hanno dati risultati incoraggianti.
Altri metodi sono quelli immunologici, che sfruttano il legame con anticorpi, utili se la tossina da rintracciare è una e nota; altrimenti può essere utile come metodo di conferma. Diversi progetti sono in corso per migliorare questi test e renderli ufficiali.

PRODUZIONE DI ANTICORPI

Da circa dieci anni è già possibile sostituire l’uso di animali nella fase di produzione, ricorrendo alla propagazione dell’anticorpo in vitro. La produzione in vitro è fortemente consigliata da parte di ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) già dal 1998*. Eppure ancora si fa uso di animali, nonostante la loro sostituzione sia già praticabile, almeno nella fase di produzione.
Più recentemente è stata messa a punto una tecnologia in grado di sostituire completamente il ricorso ad animali, anche nelle prime fasi di immunizzazione. Si tratta delle cosiddette “librerie fagiche”: un metodo di ingegneria genetica che sfrutta dei particolari virus detti fagi (si tratta di virus che infettano batteri) per clonare i geni che esprimono gli anticorpi e modificando i geni è possibile ottenere anticorpi diversi adattabili a qualsiasi antigene**. La tecnica delle librerie fagiche offre anche vantaggi di rapidità e costi contenuti.

Riferimenti:
* Peterson NC, Peavey JE. Comparison of In Vitro Monoclonal Antibody Production Methods with an In Vivo Ascites Production Technique. Contemp Top Lab Anim Sci. 1998 Sep;37(5):61-66.

Proceedings of the Production of Monoclonal Antibodies Workshop. Aug. 1999. Edited by J. E. McArdle and C J. Lund. Alternatives Research and Development Foundation.

http://altweb.jhsph.edu/mabs/ardf/hendriksen.htm
http://altweb.jhsph.edu/mabs/ardf/mcardle.html

** Flego M, Ascione A, Pini A, Mennella V, Dupuis ML, Benagiano G, Cianfriglia M. [Use of phage libraries for the in vitro production of recombinant monoclonal antibodies of predetermined specificity]. Ann Ist Super Sanita. 2002;38(4):401-10.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12760337

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