Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte III – FINALE

RICERCA SUL CANCRO

Epidemiologia. Il termine epidemiologia deriva dal greco e letteralmente significa “studio sul popolo”. Essa è l’estensione dello studio della malattia dall’individuale al collettivo. Le indagini epidemiologiche si rivolgono a interi gruppi di individui o popolazioni e includono l’osservazione dell’andamento della malattia, l’individuazione delle cause e dei fattori di rischio che ne possono indurre l’insorgenza e condizionarne la diffusione, gli studi sullo stato di salute della popolazione e quelli per individuare gli interventi atti a migliorare le condizioni di vita. Scopo principale delle indagini epidemiologiche è quindi la scoperta delle cause e dei fattori che determinano l’insorgenza delle malattie o insidiano il benessere della popolazione.
Caratteristica importante di questa metodologia è quella che tutti i dati sono ricavati dalla diretta osservazione della specie umana e quindi dei tumori spontanei che la colpiscono.
In particolare le ricerche epidemiologiche sul cancro permettono di individuare le differenze quantitative e qualitative nella sua distribuzione geografica. Si cerca una risposta alle seguenti domande:
se in una popolazione (di paesi diversi o dello stesso paese) il cancro ha maggiore (o minore) incidenza quali sono le abitudini di vita capaci di giustificare tale scarto dai valori medi? quali condizioni di vita possono giustificare la maggiore (o minore) incidenza di un particolare tipo di cancro? quanto è dovuto a fattori ambientali e quanto a fattori genetici o razziali?
Oltre a quello eclatante del fumo di sigaretta diversi sono i casi che mostrano come l’epidemiologia può avere un valore determinante per lo studio di malattie di cui ancora non si conosce la causa: per esempio constatando la maggiore incidenza del cancro cutaneo negli europei emigrati ai tropici, si è potuta correlare la malattia con l’eccessiva irradiazione ultravioletta (le pelli scure sono protette dalla melanina); il carcinoma del testicolo è raro nei neri di tutto il mondo*, una nozione che soltanto il metodo epidemiologico poteva fornirci e che porta ad una domanda: che cosa difende gli uomini di colore dal cancro al testicolo?
Il cancro del colon e del retto è frequente in Europa e nell’America settentrionale. Nel Giappone è raro, ma raggiunge la frequenza propria della popolazione statunitense, nei giapponesi immigrati negli USA.
Ciò fa pensare ad una causa legata ad un fattore ambientale e non alla razza.
Le ricerche dovrebbero essere incrementate, ed orientate verso l’obiettivo di identificare i marker biologici della carcinogeneticità, come le alterazioni cromosomiche, la presenza di agenti mutageni nei fluidi corporei, i marker cellulari dell’esposizione, e la presenza di enzimi disintossicanti, attivati dalle sostanze cancerogene. Ciò faciliterebbe l’individuazione dei primi segni di carcinogeneticità per la popolazione umana.

Ricerca in vitro:
(Vedi anche test di cancerogenesi nella parte I)
Riguardo al cancro i metodi in vitro hanno fornito informazioni che non sarebbero mai state scoperte con alcun altro metodo, quali:
• l’indipendenza delle cellule cancerose dalla membrana basale e dal mesenchima;
• la labilità dei legami che tengono unite tra loro le cellule cancerose;
• la trasformazione “spontanea” delle cellule normali in cellule cancerose.
Quest’ultimo è il fenomeno più sconcertante, ma anche il più promettente per gli studi sulla genesi del cancro, che il modello animale non può offrirci.

Le analisi sulla trasformazione cellulare individuano quei mutamenti morfologici, che forniscono i primi segni identificabili della carcinogenesi. Tra i forti vantaggi logistici dei test in vitro rispetto a quelli in vivo sui roditori, vanno ricordati la breve durata (da ore a giorni), il notevole risparmio economico, e le minuscole quantità (dai microgrammi ai nanogrammi) di sostanze chimiche richieste, cosa che garantisce maggiore sicurezza per gli operatori e l’ambiente.

Tessuti umani ricostruiti: strutture tridimensionali di cellule coltivate su un sistema di supporto, sviluppati per l’occhio, la pelle il polmone, il tratto gastrointestinale e i rivestimenti della bocca e della vagina e nell’industria già sostituiscono gli animali in una vasta gamma di test. Questi studi permettono di prevedere le conseguenze funzionali come le alterazioni genetiche o i cambiamenti nella crescita cellulare, che una molecola può causare su una cellula del corpo umano. Recentemente la AP Reserch di Baltimora ha messo ha punto un sistema di coltivazione simultanea di più tessuti, che è in grado di simulare interazioni complesse come la trasformazione di un prodotto chimico in un altro causata dal metabolismo di un organo, che a sua volta influenza gli altri**.

Ricerca in silico

Microarray a DNA:
La tecnologia dei microarray a DNA è già stata descritta precedentemente. Questa metodologia di analisi promette anche risultati importanti per l’individuazione precoce di mutamenti nell’espressione dei geni, dovuti a sostanze cancerogene o altre tossine, molto prima dello sviluppo di effetti più invasivi, grazie alla capacità di esaminare molti geni simultaneamente.
Nel 2003 “New Scientist” pubblicò l’articolo “The cancer revolution”***, in cui si descrivevano i progressi effettuati nella ricerca contro il cancro grazie ai microarray:
– presso l’Università del North Carolina, è stato scoperto che il cancro al seno può originarsi da diversi tipi cellulari, non solo uno, come si sospettava precedentemente;
– presso la Novartis Research Foundation di San Diego sono stati chiariti alcuni meccanismi della metastasi e osservato la differenza rispetto a quanto si credeva dai test su animali.

Riferimenti:
* Hill MJ, Drasar BS, Hawksworth G, Aries V, Crowther JS, Williams RE. Bacteria and aetiology of cancer of large bowel. Lancet. 1971 Jan 16;1(7690):95-100.

** Goldberg AM, Hartung T. Protecting more than animals. Sci Am. 2006 Jan;294(1):84-91.

*** Hamilton, Garry. The cancer revolution. New Scientist;8/23/2003, Vol. 179 Issue 2409, p36
ABSTRACT: http://connection.ebscohost.com/c/articles/10713533/cancer-revolution%5D

RICERCA SULL’AIDS

– Studi epidemiologici:
Lo studio degli stili di vita ha contribuito in modo cruciale alla comprensione della malattia, correlando la sua diffusione a particolari costumi come ad esempio lo scambio di siringhe tra tossicodependenti.

– Studi clinici:
Venivano eseguiti già nel 1987 alla George Town University di Washington e ancora oggi vengono eseguiti sui numerosi individui infetti da HIV ma che non contraggono l’AIDS. Essi hanno dimostrato, ad esempio, che la produzione di sostanze naturali da parte dell’organismo (chiamate chemochine) può essere responsabile della protezione naturale contro l’AIDS [1].

– Metodi genetici e biomolecolari:
L’HIV venne isolato dai tessuti di pazienti infetti e studi genetici ne hanno delineato meglio le caratteristiche, non gli esperimenti su animali.
Lo stesso Prof. Gallo, un pioniere della ricerca sull’AIDS, menziona principalmente contributi scientifici provenienti dalla ricerca biomolecolare, non test su animali [2]: oltre alle già citate chemochine, la comprensione della struttura esterna dell’HIV, il modo in cui entra nelle cellula e l’importanza dei fattori genetici.

– Metodi in vitro:
Grazie a test su cellule e tessuti venne scoperta la struttura di un importante enzima dell’HIV, aiutando a sviluppare i primi farmaci [3]. Lo studio su tessuti da donatori, come linfonodi, ha consentito di comprendere l’interazione dell’HIV con il sistema immunitario. Sono poi utilizzabili colture di cellule dall’epitelio di retto e vagina umani per comp
rendere l’attività del virus a questo livello.

– Metodi in silico:
Negli anni ‘90 vennero sviluppati modelli che spiegavano il ciclo dell’HIV nel corpo dei pazienti aiutando a sviluppare terapie mirate [4]. Più recentemente ne sono stati sviluppati altri come l’HAART del Virginia Bioinformatics Institute che modella il metabolismo del farmaco AZT nell’organismo umano [5].

Riferimenti:
[1] Garzino-Demo A, Moss RB, Margolick JB, Cleghorn F, Sill A, Blattner WA, Cocchi F, Carlo DJ, DeVico AL, Gallo RC. Spontaneous and antigen-induced production of HIV-inhibitory beta-chemokines are associated with AIDS-free status. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Oct 12;96(21):11986-91.
FULL TEXT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC18399/

[2] Robert C Gallo. A reflection on HIV/AIDS research after 25 years. Retrovirology. 2006; 3: 72.

[3] S Seelmeier, H Schmidt, V Turk, and K von der Helm. Human immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited by pepstatin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 September; 85(18): 6612–6616.

[4] Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, Johnson VA, Emini EA, Deutsch P, Lifson JD, Bonhoeffer S, Nowak MA, Hahn BH, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature. 1995 Jan 12;373(6510):117-22.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7529365

[5] Patrick C. Bradshaw, Jiaxin Li, and David C. Samuels. A computational model of mitochondrial AZT metabolism. Biochem J. 2005 December 1; 392(Pt 2): 363–373.
FULL TEXT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1316272/

STUDIO DI MALATTIE GENETICHE

Studi clinici:
– Diagnosi prenatale: la genetica medica si prefigge di controllare le malattie genetiche attraverso la prevenzione e la diagnosi finalizzata all’applicazione di cure specialistiche adeguate. Analisi genetiche (il DNA si estrae facilmente e rapidamente dal sangue) e l’esame dell’albero genealogico dei futuri genitori del nascituro permettono di prevedere la possibilità di insorgenza di una malattia genetica e quindi di prevenirla o di trattarla adeguatamente.
Il prelievo di cellule fetali dai villi coriali attorno alla decima settimana di gravidanza e quello del liquido amniotico attorno alla sedicesima settimana consentono di acquisire materiale genetico del feto da analizzare permettendo di escludere la maggior parte delle patologie cromosomiche numeriche o strutturali responsabili di molte sindromi genetiche.

– La metodica della FISH (Ibridazione Fluorescente In Situ) permette di determinare, attraverso l’utilizzo di sonde molecolari marcate, una specifica mutazione responsabile di una malattia genetica.
La PCR, tecnica che consiste nell’amplificazione di una specifica sequenza di DNA, permette con assoluta precisione di rivelare la presenza di una malattia di cui si sospetta l’insorgenza, quali la fibrosi cistica, malattia molto diffusa a causa della frequenza assai elevata con cui la mutazione responsabile viene riscontrata nella popolazione (all’incirca 1:20). La PCR è una tecnica che rivoluzionato la ricerca biomedica negli ultimi anni e non deve nulla alla sperimentazione animale.
In passato, tecniche molto semplici, come l’osservazione al microscopio dei cromosomi, ha consentito di comprendere l’origine di malattie come la sindrome di Down. Dal 2003 è disponibile la mappatura del genoma umano, frutto di un progetto internazionale (Human Genome Project) iniziato nel 1990: la conoscenza dei geni e del loro ruolo si può valutare studiando persone con disfunzioni per capire se esse dipendano dal mal funzionamento, dalla mancanza o dall’aggiunta segmenti di DNA.

È possibile ottenere informazioni sulla funzione di un gene non noto confrontando la proteina da esso prodotta con proteine dalla struttura simile archiviate in databases; inoltre, grazie all’impiego di DNA chip, è possibile raccogliere un numero elevato di dati per paziente, che confrontati con i
dati di altri pazienti, consentono di studiare poliformismi genetici (diverse forme di uno stesso gene) e quindi eventuali associazioni tra geni e malattie ed eventualmente la funzione stessa del gene. Ad esempio si possono confrontare i profili genetici di tessuti normali e tessuti cancerosi per evidenziare eventuali componenti genetiche della malattia.

Un software per lo studio della funzione dei geni senza ricorrere ad animali è prodotto dalla Molecular Applications Group [1] (California).

Studi clinici, di popolazione e studi su gemelli identici: alcune popolazioni umane possono differire per incidenza di una malattia sia per ragioni legate ad abitudini di vita sia per caratteristiche genetiche.

Anche lo studio su gemelli identici aiuta a comprendere meglio la genetica umana evidenziando anche quanto le cause di patologie come il cancro, l’asma, l’osteoporosi, l’artrite o il diabete siano causate da fattori ambientali e quanto da genetici. Presso l’Istituto Superiore di Sanità esiste il Registro Nazionale dei Gemelli; si conducono studi sulla celiachia [2]; sul ruolo genetico delle patologie più comuni (progetto europeo GenomEutwin: http://www.genomeutwin.org); sui meccanismi della coagulazione del sangue per comprendere situazioni patologiche che portano alla formazione di trombi e all’ictus cerebrale (progetto europeo Euroclot [3]).

Metodi in silico:
Il computer sta diventando uno strumento sempre più importante nella ricerca genetica: un esempio è il supercomputer Avogadro, progettato dall’azienda italiana Eurotech, in grado di analizzare enormi quantità di dati genetici. Avogadro si trova presso LitBio, il laboratorio interdisciplinare di tecnologie bioinformatiche a Milano. [4]

Riferimenti:
[1] Lee C, Irizarry K. The GeneMine system for genome/proteome annotation and collaborative data mining. IBM Syst J. 2001;40:592–603.

Parker DS, Gorlick MM, Lee CJ. Evolving from bioinformatics in-the-small to bioinformatics in-the-large. OMICS. 2003 Spring;7(1):37-48.
FULL TEXT: http://www.cs.ucla.edu/~stott/bioinf/OMICS.7.1.p37-48.pdf

[2] Nistico, L; Cotichini, R; Fagnani, C; Stazi, MA; Coto, I and Greco, L. Concordance, Disease Progression and Heritability of Celiac Disease in Italian Twins. Twin Research and Human Genetics, Vol. 7, No. 4, Aug 2004: 369-370.

[3] Carter AM, Cymbalista CM, Spector TD, Grant PJ. Heritability of clot formation, morphology and lysis: The EUROCLOT study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:2783-2789

[4] http://www.eurotech.com/it/sala+stampa/news/?214

NEUROSCIENZE

Non includeremo questo argomento nel dossier perchè ne abbiamo già parlato nei seguenti articoli:
https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/16/rimpiazzare-gli-animali-nelle-neuroscienze/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/07/alternative-in-psicologia-e-nelle-neuroscienze-le-reti-neurali/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/16/ricerche-sul-cervello-inaffidabili-modello-animale-vs-neuroimaging/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/14/fettine-di-tessuto-cerebrale-umano-in-vitro/

http://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/02/26/microstimolazione-elettrica/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/14/studio-sullepilessia-con-i-metodi-alternativi/

DIDATTICA

Nonostante l’impiego di animali a fini didattici sia quantitativamente marginale rispetto al totale (circa 0,3%), l’impatto è rilevante per la formazione scientifica e morale dello studente. 
Il Decreto Legislativo 116/92 stabilisce anche che l’impiego di metodi sostitutivi debba sempre essere preferito, inoltre rende particolarmente restrittivo il ricorso agli animali a scopo didattico attraverso la necessità di rilascio di una specifica autorizzazione.
In ambito didattico c’è una più che ampia disponibilità di metodi sostitutivi all’uso di animali.
Stando alle statistiche ufficiali, l’impiego principale sembra essere l’addestramento chirurgico.
L’evoluzione tecnologica ha portato innovazioni notevoli nella chirurgia: lo sviluppo della chirurgia
miniinvasiva ha aperto nuovi scenari: grazie alle fibre ottiche, in certe situazioni è possibile operare non “a cielo aperto” ma praticando piccoli fori sul corpo del paziente atti a inserire i mezzi di ripresa video e gli strumenti. Il chirurgo quindi osserva la scena da uno schermo e maneggia strumenti diversi dai tradizionali. Questa procedura, essendo del tutto nuova rispetto alle precedenti, non può essere improvvisata e richiede un training specifico, anche per i chirurghi esperti.
D’altra parte è fortemente avvertita in questo momento l’esigenza di una migliore formazione della classe medica, anche dagli stessi operatori sanitari, che desiderano acquisire validi fondamenti per affrontare più serenamente la pratica clinica.

Sia nell’addestramento degli apprendisti sia nell’aggiornamento dei medici esperti in alcuni casi si è fatto e si fa uso di animali, ma proprio perché si è manifestata l’esigenza di un innalzamento qualitativo nell’istruzione e nelle prestazioni, recentemente si è fatta strada la tendenza a ricorrere a simulatori, cioè apparecchiature artificiali in grado di mimare con precisione le caratteristiche dell’organismo umano, che è il vero oggetto della pratica del medico. La simulazione in medicina sta dando impulso a un effettivo e proficuo rinnovamento nella didattica.
Per simulatore non si intende solo il tradizionale “manichino”, peraltro molto utile in fase iniziale, perché grazie alle applicazioni dei computer e alla realtà virtuale oggi si dispone di strumenti molto più raffinati, che permettono di interagire con le strutture anatomiche.
Gli stessi manichini hanno subito una significativa evoluzione e oggi, oltre all’osservazione delle strutture anatomiche, sono possibili manovre diagnostiche e chirurgiche, come l’esecuzione di suture o iniezioni. Inoltre, grazie alle tecniche di visualizzazione con computer, possiamo osservare organi e formazioni anatomiche da varie angolazioni, scomporli in parti, sezionarli virtualmente ecc.
Vantaggi nell’uso dei simulatori rispetto agli animali:
– il simulatore riproduce le caratteristiche anatomiche e fisiologiche dell’essere umano, quindi è un
vero modello semplificato dell’organismo umano
– utilizzando l’animale, si rischia di adattare le manovre operative all’anatomia dell’animale stesso,
dovendo poi fare attenzione, una volta passati a operare sull’uomo, a riconoscere le differenze fra le
due specie, creando cioè una difficoltà in più, invece che semplificare il processo di apprendimento
– sul simulatore si possono studiare prima l’anatomia e la fisiologia di un organismo sano, comprese
tutte le varianti che rientrano nel quadro della normalità, e in seguito passare al patologico
– c’è la possibilità di annoverare una vasta gamma di situazioni cliniche, anche quelle rare, e avere così un quadro completo di tutte le evenienze alle quali ci si può trovare di fronte nella pratica clinica
– sono possibili lunghe fasi di apprendimento senza la continua presenza di un insegnante
– si può predisporre un gradiente di complessità e difficoltà con vari “livelli”
– l’esperimento può essere ripetuto un numero indefinito di volte
– l’eventuale errore non comporta alcun danno
– il computer può operare una continua verifica degli errori
– il livello di preparazione tra i diversi studenti e istituti viene maggiormente uniformato
– il simulatore può essere usato per eseguire test di valutazione dell’apprendimento (sarebbe così possibile inserire una parte pratica in tutti gli esami del corso di studi, cosa che a tutt’oggi non viene fatta).
Lo svantaggio più limitante è forse quello di non essere riusciti a simulare situazioni come il sanguinamento, sebbene si stia progredendo anche in questo campo.

Un’alternativa è l’impiego di cadaveri: è recente il brevetto del Dipartimento di Neurochirurgia dell’Università dell’Arkansas che consiste nell’impiego di cadaveri o parti di essi perfusi per esercitazioni di chirurgia [1]. La perfusione consiste nel far circolare del liquido pulsante all’interno dei vasi del cadavere, simulando in questo modo la circolazione sanguigna e la consistenza dei tessuti vivi, ovviando così al limite tecnico dell’impiego del cadavere. In Italia tuttavia, l’uso del cadavere è impedito per ragioni culturali e ostacolo normativi, mentre è diffuso in Francia: molti chirurghi italiani si recano oltralpe per questa ragione.
Qualche esempio italiano ed estero:
– Il Visibile Human è un atlante anatomico multimediale di 55 gigabyte, ottenuto da due volontari, un uomo e una donna, che hanno destinato i loro corpi, dopo la morte, alla realizzazione di questo progetto. I corpi sono stati congelati e poi affettati in sezioni sottili, che sono state fotografate, analizzate con la TC (tomografia computerizzata) e la RM (risonanza magnetica) e infine digitalizzate. Elaborando le immagini si sono ricavate ricostruzioni tridimensionali. L’utente può anche ricavare sezioni trasversali, sagittali, oblique di un organo, o visioni in movimento. Il Visible Human può anche essere usato come base per l’allestimento di modelli tridimensionali materiali.
In Italia il Cilea (Consorzio Interuniversitario Lombardo per l’Elaborazione Automatica) in collaborazione col Politecnico di Milano gestisce il “mirror site” del Visibile Human, che contiene l’intera banca dati per l’Europa continentale: http://www.nlm.nih.gov/research/visible/vhpconf98/AUTHORS/GUGLIELM/GUGLIELM.HTM Un piccolo campione di queste immagini, visibile senza registrarsi al sito, è disponibile su
http://www.nlm.nih.gov/research/visible/visible_human.html, mentre chi vuole scaricare tutto il materiale o parte di esso può farlo gratuitamente richiedendolo però al gestore del sito.

– Michelangelo è stato realizzato al Politecnico di Milano: è un robot capace di simulare le principali malattie cardiache, riproducendo anche i rumori cardiaci e permettendo così agli studenti di imparare a effettuare correttamente le manovre diagnostiche; fa parte della simulazione anche l’elettrocardiogramma.

– A Napoli, a Città della Scienza, si trova MEDISIM, Centro di Simulazione per la Formazione Medico Chirurgica ed Infermieristica. Qui si utilizzano due robot, un adulto e un bambino, per la simulazione di emergenze cardiologiche e respiratorie, eseguendo su di essi manovre di rianimazione, somministrazione di gas anestetici e di farmaci, intubazione e ventilazione, defibrillazione, assistenza a traumi e fratture.

– A questo scopo è utilizzato il manichino SAM, che simula diverse condizioni di emergenza medica e già adottato in un progetto formativo per l’addestramento di 600 medici nella Regione Veneto.

– Presso l’Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” è in corso il progetto OPTIMISE: Ottimizzazione della sicurezza del PazienTe chirurgico attraverso l’Integrazione di Modelli simulativi ed Intefacce Sensoriali, che si propone la realizzazione di un simulatore inno
vativo utilizzabile sia in chirurgia open (tradizionale) sia mini-invasiva, sufficientemente economico da poter essere acquistabile dai centri di formazione chirurgica. L’utilizzo di questo simulatore consentirà di effettuare gli interventi più complessi in modo virtuale prima del vero intervento, in modo che il chirurgo possa prepararsi ai passaggi più difficili della procedura senza rischi per il paziente.

– In Sardegna, a Pula (CA) si trova il CRSSSS (Center for Advanced Studies Research and Development in Sardinia, http://www.crs4.it), un centro di ricerca interdisciplinare che sviluppa tecniche avanzate di simulazione tramite il computer, e che si occupa tra le altre cose anche di applicazioni biomediche. Tra i progetti in corso c’è IERAPSI (Integrated Environment for Rehearsal and Planning of Surgical Intervention), finalizzato allo studio di metodiche di addestramento e pianificazione chirurgica. Nell’ambito di questo progetto è stato realizzato un sofisticato simulatore per la chirurgia dell’osso temporale. Infatti i simulatori si possono utilizzare anche per la pianificazione chirurgica, per interventi in cui si richieda un elevato livello di precisione: si acquisiscono preventivamente immagini del corpo del paziente tramite TC e RM, e da queste si elabora la ricostruzione tridimensionale che viene usata per la simulazione dell’intervento.
Nel dispositivo in questione il chirurgo interagisce con un display e due manopole, che trasmettono i movimenti delle sue mani agli strumenti chirurgici virtuali che agiscono all’interno del campo operatorio. Le manopole gli forniscono anche il force-feedback, cioè un ritorno di sensazioni tattili in tempo reale. Egli può cioè avvertire la consistenza e la resistenza che il tessuto offre agli strumenti chirurgici: un dispositivo di questo tipo è detto APTICO (haptic). In questa simulazione c’è anche una efficace resa degli effetti visivi secondari che vengono prodotti dall’azione degli strumenti sull’osso: l’erosione, il “fango” prodotto dalla fresa, il sanguinamento, l’irrigazione prodotta dal trapano, l’effetto dell’aspiratore chirurgico ecc. Tutto ciò costituisce uno scenario che si modifica istantaneamente, mano a mano che l’azione virtuale dell’operatore sulle strutture anatomiche ne modifica l’assetto. C’è anche la possibilità di confrontare la realtà con la simulazione: su http://www.crs4.it/vic si possono guardare in contemporanea il filmato reale (fatto in endoscopia) e quello simulato.

– Presso l’Università degli Studi di Pisa è stato creato ENDOCAS, un centro di eccellenza per la chirurgia assistita al calcolatore (computer-aided surgery). Il programma di ricerca del centro verte, oltre che sulla chirurgia assistita, in cui le capacità del chirurgo si sommano alle potenzialità offerte dal computer, anche sulla creazione di materiale didattico innovativo e di simulatori.

Una curiosità: negli Stati Uniti alla scuola di Medicina dell’Ospedale Mount Sinai di NewYork si è anche pensato di creare il cosiddetto paziente standardizzato. Per questo scopo vengono assunti degli attori che devono “imparare la parte” del malato in modo da stimolare l’abilità degli apprendisti nell’individuare i sintomi e fare diagnosi (www.mc.uky.edu/meded/cstac/standpt.asp) [2].

Su http://www.interniche.org è disponibile un database di molti metodi utilizzabili nella didattica, e la possibilità di ottenerli in prestito.

Su http://www.ethical-learning.org è disponibile un database interattivo sui metodi sostitutivi nella didattica scientifica, creato da I-CARE (International Center for Alternatives in Research and Education, http://www.icare-worldwide.org/).
Il database contiene circa 900 alternative per più di 200 specie animali. Se si vogliono conoscere le possibili alternative a uno specifico esperimento, si compilano i campi relativi alle caratteristiche dell’esperimento (argomento e specie animale), e si ottengono i link ai siti internet o i contatti delle ditte che forniscono il relativo simulatore. Il sito fornisce altresì numerosi link a enti o istituzioni che si occupano di metodi sostitutivi, per esempio: ALTBIB, Bibliography on Alternatives to the Use of Live Vertebrates in Biomedical Research and Testing, http://toxnet.nlm.nih.gov/altbib.html; FRAME, Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments, http://www.frame.org.uk .

In ambito odontoiatrico, un numero notevole di corsi di perfezionamento utilizzano simulatori, soprattutto per l’apprendimento di procedure di particolare delicatezza (per es. la preservazione dell’integrità del nervo alveolare mandibolare durante l’inserimento di impianti in questa sede,
http://www.jetimplant.com/Catalogo/Catalogo.pdf, pag 122). Inoltre all’estero si tengono corsi di dissezione e procedure chirurgiche. In altri casi non si usano animali da laboratorio ma parti di essi provenienti dal “circuito alimentare” (testa del maiale recuperata dalla macelleria).

Si usano anche denti estratti, denti artificiali in gesso o resina, modelli trasparenti, manichini su cui possono essere montati sia denti artificiali che naturali.

Altri link:
http://www.mc.manchester.ac.uk/services/highperformancevisualization/haptics
http://www.sve.man.ac.uk/mvc: sito del Manchester Visualization Center
http://www.anatomy.tv: dissezioni anatomiche virtuali, elaborate graficamente
http://www.mc.uky.edu/meded/cstac/sims.asp: Università del Kentucky, simulatori
http://www.websurg.com: archivio di filmati sulla chirurgia mini-invasiva e laparoscopica
http://www.sensable.com/industries-medical-dental.htm: visualizzazioni 3D e simulatori
Simulatori in medicina veterinaria:
University of California Davis Centre for Animal Alternatives Information
http://lib.ucdavis.edu/dept/animalalternatives/index.php
http://www.rescuecritters.com: simulatori per esercitazioni su procedure veterinarie e tecniche di salvataggio di animali.

Riferimenti:
[1] Emad Aboud, Carlos Ernesto Suarez, Ossama Al-Mefty and M. Gazi Yasargil. New Alternative to Animal Models for Surgical Training. ATLA 32, Supplement 1, 501–507, 2004
FULL TEXT: http://www.frame.org.uk/atla_article.php?art_id=680&pdf=true

[2] SA Haist, AR Hoellein, G Talente, ML Jessup, JF Wilson. Improving Students’ Sexual History Inquiry and HIV Counseling with an Interactive Workshop Using Standardized Patients. J Gen Intern Med. 2004;19:549-553.

Haist SA, Lineberry MJ, Griffith CH, Hoellein AR, Talente, GM, Wilson JF. Sexual History Inquiry and HIV Counseling: Improving Clinical Skills and Medical Knowledge through an Interactive Workshop Utilizing Standardized Patients, Advances in Health Sciences Education. 2008; 13(4):427-434

Feddock CA, Hoellein AR, Griffith CH, Wilson JF, Lineberry MJ, Haist SA. Enhancing Knowledge and Clinical Skills Through an Adolescent Medicine Workshop. Arch Pediatr Adolesc Med. 2009;163(3):256-260.
Hoellein AR, Griffith CH, Lineberry MJ, Wilson JF, Haist SA. A Complementary and Alternative Medicine Workshop Using Standardized Patients Improves Knowledge and Clinical Skills of Medical Students. Alternative Therapies in Health and Medicine. Nov/Dec 2009.

Haist SA, Wilson JF, Lineberry MJ, Gibson JS, Griffith CH. A Randomized Controlled Trial Using Insinuated Standardized Patients to Assess Residents’ Domestic Violence Skills following a Two-hour Workshop. Teaching and Learning in Medicine. 2007; 19: 336-342.

Haist SA, Wilson JF, Pursley, HG, Jessup ML, Gibson JS, Kwolek DS, Stratton TD, Griffith CH. Domestic Violence: Increasing Knowledge and Improving Skills with a Four-Hour Workshop Using Standardized Patients. Acad Med. 2003;78:S24-S26.

Griffith CH, Wilson JF, Langer S, Haist SA. Housestaff Nonverbal Communication Skills and Standardized Patient Satisfaction. J Gen Intern Med. 2003; 18: 170-174.
Duke MB, Griffith CH, Haist SA, Wilson JF. A Clinical Performance Exercise for Medicine-Pediatrics Residents Emphasizing Complex Ambulatory and Psychosocial Skills. Acad Med. 2001; 76: 1153-1157.

RICERCA AMBIENTALE E STUDI FAUNISTICI: Metodi non-cruenti

Per molti settori della ricerca zoologica attinenti ad aspetti di distribuzione, ecologia e conservazione delle specie, si ha la possibilità di ricorrere a metodi di indagine assolutamente incruenti per la fauna. In questa sede ne presentiamo alcuni.
– Ricerche eco-faunistiche: per le specie animali di medie-grandi dimensioni i metodi di ricerca in ambito faunistico non prevedono più l’uccisione dell’esemplare. I più recenti protocolli di studio, cattura e manipolazione dei grandi mammiferi [1] sono ottimi esempi di come si possa studiare la fauna in natura ingerendo il meno possibile nella biologia della specie che si sta indagando. Come non ricordare, d’altra parte, che le origini delle scienze – e nello specifico delle scienze naturali – sono nate e si sono sviluppate sulla pratica dell’osservazione e della non interferenza dell’osservatore nelle dinamiche osservate (a partire da Charles Darwin).

– Alcuni roditori, come gli Scoiattoli e i Ghiri, possono essere studiati utilizzando alcune trappole incruente costituite da tubi di plastica di idoneo diametro contenenti un’esca alimentare e contornati con scotch adesivo nella parte superiore: al passaggio forzato dell’animale nel tubo lo scotch raccoglierà alcuni peli che, una volta analizzati, testimonieranno il passaggio di quella specie. Si segnalano, in Italia, alcune recenti ricerche svolte sui micromammiferi in Umbria dal gruppo di A. Paci [2].

– Il metodo cosiddetto “naturalistico”, inoltre, fornisce dati utili sulla presenza della specie di interesse semplicemente raccogliendo sul campo peli, piume, escrementi, borre e carcasse od osservando impronte, tracce e altri segni indiretti.

– Un esempio dell’applicazione di questo metodo è dato dallo studio della fauna composta da
Mammiferi di piccole dimensioni, come arvicole, toporagni, ecc. mediante analisi delle borre di rapaci notturni. Nella dieta di barbagianni, civette e gufi, infatti, finiscono numerosi animali di difficile osservazione diretta e che è quindi possibile studiare in modo “indiretto” analizzando i frammenti di ossa e peli contenuti nei rigurgiti di questi rapaci. Questo vale anche per gli studi che coinvolgono invertebrati: è possibile utilizzare ad esempio la ricerca e l’utilizzo di esuvie (ciò che resta dell’insetto dopo la muta) e nicchi ormai vuoti, per il riconoscimento di insetti e lumache.

– l’uso di macrofotografie su soggetti viventi con cui si può giungere a costruire tabelle di riconoscimento dicotomiche efficaci e facilmente applicabili;

– La ricerca di microrganismi a fini epidemiologici può avvenire con il prelievo di materiale fecale attraverso tampone cloacale e la tempestiva tipizzazione batterica, seguendo procedure e tecniche standardizzate presso laboratori attrezzati [3] o con l’applicazione di opportuni trattamenti antielmintici in individui appositamente stabulati (Oneto et al., 2006).

– Altro esempio applicativo del metodo naturalistico, che evita catture e uccisioni, è quello legato agli studi di parassitologia, microbiologia e alimentazione effettuati attraverso l’esame delle carcasse di animali investiti su strada (Ferri e Soccini, 2001 e 2006; Nieddu et al., 1999).
• Nel caso in cui la specie si presti all’osservazione a distanza, possono essere utilizzati metodi che fanno uso delle moderne tecnologie audio-video, come l’analisi delle eco-localizzazioni per lo studio dei Chirotteri o dei Mammiferi marini (che emettono suoni a frequenze quasi sempre specie-specifiche e, quindi, identificabili “traducendo”, anche attraverso l’uso di particolari software per computer, il segnale sonoro), il riconoscimento dei canti degli Uccelli e degli Anfibi, l’emissione di canti pre-registrati per stimolare la risposta di eventuali individui presenti nella zona (come, ad esempio, nel wolfhowling per il monitoraggio del Lupo). In alcuni casi possono essere installate videocamere a controllo a distanza nei pressi dei siti di nidificazione e cova, per seguire in diretta le fasi riproduttive. Altri sistemi per valutare presenza/assenza di talune specie di medie-grandi dimensioni sono le prove fotografiche raccolte mediante apparecchi appositamente modificati per scattare nottetempo, al passaggio dell’animale, foto ravvicinate. In questo modo, collocando la macchina fotografica in un punto strategico (scelto in base alle conoscenze sull’ecologia della/e specie che stiamo studiando) e lasciandola in situ per uno o più giorni, si possono raccogliere numerosi dati di presenza: questo metodo è stato recentemente utilizzato, ad esempio, per confermare la presenza di specie rare e sfuggenti (come il Gatto selvatico o l’Orso bruno) in Appennino centrale (ad esempio nelle Marche il gruppo di lavoro di Paolo Forconi e Maurizio Fusari, dello Studio Chiros, ha accertato con questo metodo la presenza di un individuo erratico di Orso bruno nei Monti Sibillini nel mese di ottobre del 2006)

– Un discorso a parte meritano le indagini che prevedono la cattura dell’animale per il marcaggio di uno o più individui tramite microchip sottocutaneo, contrassegni applicati all’esterno (come le placche auricolari o la colorazione della pelliccia dell’animale) e piccoli trasmettitori dorsali destinati al telerilevamento (tecniche di radio-tracking) o all’osservazione a distanza di animali molto mobili o indistinguibili individualmente dalla livrea. In molti casi si è constatato che lo stress causato al momento della cattura e del rilascio, il peso degli apparecchi utilizzati, così come l’emissione di onde radio e l’infiltrazione di agenti patogeni nei siti di inserimento sottocutanei abbiano avuto un ruolo determinante sul tasso di mortalità e morbilità nei casi studiati.

– Per ora, comunque, non esiste un marcaggio perfetto, anche se alcune metodiche come il riconoscimento delle caratteristiche individuali morfologiche, di livrea o il pattern di colorazione, attraverso fotografie ravvicinate o l’utilizzo di microchips, inseriti in PIT tags (cioè passive integrated transponder, Biomark ® http://www.biomark.com) e iniettati sottocute o nei sacchi linfatici (Anfibi) con le necessarie attenzioni sanitarie, sembrano dare i migliori risultati (Keck, 1994; Buhlman e Tuberville, 1994; Elbin e Burger, 1994; Bernini, Barbieri e Vercesi, 2001).

– Cura del disegno sperimentale: nelle attività di monitoraggio e ricerca di piccoli animali che necessitano di metodi riferibili al “trappolaggio incruento” (raccolta di peli o cattura di animali mediante trappole che non provocano menomazioni o ferite né uccidono gli individui), uno dei fattori che incide pesantemente sul risultato finale dello studio e, soprattutto, sullo stato di salute degli esemplari catturati è il cosiddetto “sforzo di campionamento”, ovvero il tempo necessario per raccogliere dati esaustivi e attendibili. Più ampio sarà tale sforzo (commisurato alla biologia della/e specie che stiamo studiando), maggiori sono le probabilità che nessun animale trappolato subisca danni e migliore sarà anche il risultato finale. In questi studi è molto importante, dunque, definire a priori il posizionamento delle trappole e la relativa tempistica prevista per il monitoraggio delle stesse.

– Ricerche genetiche: con i progressi delle tecniche di biologia molecolare e la loro sempre maggiore affidabilità/affinità delle moderne tecnologie in uso nei laboratori di genetica oggi nella maggior parte dei casi è sufficiente raccogliere un piccolo campione biologico per poter procedere con le specifiche analisi e portare a termine ricerche genetiche che fino a poco tempo fa non erano neppure concepibili senza la morte di uno o più animali.

– Segnaliamo, ad esempio, il metodo messo a punto per il riconoscimento specie-specifico dei
Mammiferi Mustelidi (come faina, martora, puzzola), elaborato dall’Università degli Studi di Perugia [4], che si basa sull’analisi del DNA contenuto in peli o escrementi raccolti sul campo e che permett
e di riconoscere non solo la specie, ma – una volta acquisiti più dati relativi ad una certa zona – anche il singolo individuo e il grado di parentela con gli altri individui della stessa specie.

– Per quanto riguarda l’identificazione di infezioni portate da microrganismi patogeni (come funghi, batteri e virus) la ricerca biomolecolare ha fatto buoni passi in avanti e in molti casi è oggi possibile verificare la presenza dell’agente infettante senza dover necessariamente uccidere l’esemplare esaminato. Un valido esempio è dato dalla recente applicazione delle tecniche di biologia molecolare come strumento diagnostico per la ricerca del pericoloso fungo Batrachochytrium dendrobatidis che colpisce mortalmente alcune specie di Anfibi.

– Oltre alla caratterizzazione istologica che obbliga alla disponibilità di tessuti prelevati spesso da individui viventi (come falangi delle dita, parti dell’epidermide ventrale, astuccio corneificato dell’apparato boccale delle larve), la diagnosi può infatti avvenire con l’uso di due tecniche meno invasive: la caratterizzazione genica [5] e quella immunoistochimica [6].

– Un gruppo di ricercatori australiani [7], poi, è riuscito a mettere a punto un test quantitativo che permette di indicare il livello dell’infezione di un animale potendo rilevare anche una sola zoospora del fungo in ciascun campione analizzato, senza procurare lesioni o tagli all’animale perché si agisce semplicemente sfregando un tampone sulla pelle dell’anfibio [8].

Note e riferimenti:
[1] Citiamo, ad esempio, il “Piano d’azione nazionale per la conservazione del Lupo (Canis lupus)” il “Piano d’azione nazionale per il Camoscio appenninico (Rupricapra pyrenaica ornata)”, curati dal Ministero dell’Ambiente e dall’Istituto Nazionale della Fauna Selvatica.

[2] Gaggi A. & Paci A.M., 2003. Micromammiferi dei Piani Carsici di Colfiorito (Perugia –
Macerata). Hystrix, It. J. Mamm. (n.s.) suppl.: 119-120;

Paci A.M., Romano C. & Palanga S., 2003. Micromammiferi del Parco regionale di Monte Cucco (Perugia). Hystrix, It. J. Mamm. (n.s.) suppl.: 129-130

[3] Ferri V. & C. Soccini, 2005. Nuovi habitat per Rana latastei nel S.I.C. di Monticchie
(IT2090001, Somaglia, Lodi). Comunicazione al PPP05 – Pond, Puddles and Pools
(Trieste, 20-21 giugno 2005)

[4] Vercillo F., Lucentini L., Palomba A., Panara F. & Ragni B., 2005. Riconoscimento specie-specifico di Mustelidi mediante analisi biomolecolare applicata a indici di presenza indiretta. 66° Congresso UZI, Roma. Programma, Riassunti

[5] Tecnica di biologia molecolare che sfrutta la Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) come strumento diagnostico. Dopo l’estrazione del DNA totale dell’individuo, effettuata anche soltanto con un minimo prelievo di sangue, è possibile rilevare la presenza dell’organismo patogeno mediante l’utilizzo di sequenze oligonucleotidiche (primers) altamente specifiche.

[6] Questa tecnica si avvale alla disponibilità di anticorpi policlonali per test di immunolocalizzazione: i campioni conservati di individui già morti per cause naturali o per la possibile infezione, vengono sottoposti a queste particolari colorazioni che nel caso di effettiva infezione mettono in evidenza in modo inequivocabile l’avvenuta reazione.

[7] Ricercatori del CSIRO, Australian Animal Health Laboratory (http://www.csiro.au/)

[8] Citiamo, tra gli altri:
Boyle DG, Boyle DB, Olsen V, Morgan JA, Hyatt AD. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis Aquat Organ. 2004 Aug 9;60(2):141-8.

Mini-approfondimento sui metodi in silico SAR e QSAR

SAR e QSAR sono gli acronimi rispettivamente di “relazione struttura-attività” e “relazione quantitativa strutture – attività”: si tratta di modelli in grado di predire i possibili effetti di una sostanza sull’organismo confrontandola con sostanze strutturalmente simili di cui sono già noti gli effetti. I modelli QSAR sono descrizioni matematiche delle relazioni intercorrenti fra le proprietà fisico-chimiche delle molecole e la loro attività biologica. Per costruire un modello QSAR si seleziona un gruppo di sostanze sulla base della similitudine per struttura e meccanismo di azione biologica e all’interno della classe si selezionano alcune sostanze rappresentative. Dopodichè si descrivono le caratteristiche strutturali della sostanza (p.e.: solubilità in acqua, punto di fusione, punto di ebollizione, densità, indice di rifrazione, potenziale di ionizzazione, etc.). Si effettua poi un’analisi che evidenzia alcune caratteristiche comuni tra le sostanze. Si costruisce infine il modello QSAR, che mette in relazioni le caratteristiche chimiche con gli effetti biologici che si reperiscono in letteratura.
Sono modelli QSAR, già diffusamente impiegati dall’industria, il DereK, TopKat e CASE, per lo studio della sensibilizzazione cutanea , mutagenesi e cancerogenesi, tossicità cronica delle sostanze chimiche. Molti altri sono utilizzati o in via di sviluppo.

[Adattato dal dossier LAV 2007 “Un’altra ricerca è possibile – Metodi sostitutivi alla sperimentazione animale”: http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf]

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