Colture 3D vs 2D: tessuti umani 3D per studi di nefrotossicità

„Il costo impressionante per portare un farmaco sul mercato, unito all’elevato tasso di fallimenti dei potenziali composti, a causa dell’inaspettata tossicità per l’uomo, nelle prime fase cliniche rende indispensabile lo sviluppo di modelli per meglio predire la tossicità dei farmaci più rilevanti per l’essere umano. La nefrotossicità [che causa danni ai reni] indotta dai farmaci rimane particolarmente difficile da predire sia nelle fasi pre-cliniche che in quelle cliniche e passa spesso inosservata finché il paziente non dev’essere ricoverato. I correnti metodi pre-clinici per determinare la tossicità renale includono le colture di cellule 2D e i modelli animali, entrambi non in grado completamente di ricapitolare la risposta umana in-vivo ai farmaci, contribuendo al tasso di fallimento delle fasi di sperimentazione clinica. Abbiamo sviluppato un modello di tessuto renale 3D usando cellule corticali epiteliali umane immortalizzate con funzioni renali simili a quelle presenti in-vivo. Questi tessuti 3D sono stati confrontati con cellule 2D, sia per la tossicità acuta (3 giorni) che cronica (2 settimane) indotta da cisplatino, gentamcina, doxorubicina utilizzando sia la tradizionale secrezione di LDH che i biomarcatori pre-clinici Kim-1 e NGAL come valutazioni di tossicità. I tessuti 3D sono risultati più sensibili alla tossicità indotta dai farmaci e, a differenza delle cellule 2D, sono potuti essere utilizzati per monitorare la tossicità cronica dovuta alle dosi ripetute. L’inclusione di questo modello di tessuto per testare farmaci prima dell’inizio della fase I dei trial clinici consentirebbe una migliore previsione degli effetti nefrotossici di nuovi farmaci.“

„Si stima che ci vogliano 9 anni e costi tra gli 0.8 e 1.7 miliardi di dollari per portare un farmaco attraverso i trial clinici. […] circa l’8% dei farmaci che entrano nella fase I raggiungeranno poi il mercato. Questo basso tasso é causato da diversi fattori, tra i quali la mancanza di metodi ben consolidati in grado di prevedere con precisione l’utilità clinica e la tossicità dei farmaci durante lo sviluppo pre-clinico. L’iniziativa „Critical Path“ [1] della FDA richiede lo sviluppo di strumenti migliori per incrementare il successo dei farmaci che passano dalla sperimentazione pre-clinica a quella clinica. Incluso in questo processo vi é lo sviluppo di modelli di tessuto umano in grado di predire meglio le risposte umane in-vivo, tra cui la tossicità d’organi“.

Ed é proprio della tossicità sugli organi che i ricercatori si occupano in questo articolo, sopratutto degli effetti nefrotossici, difficilmente riscontrabili nei modelli animali e in 2D.

Come si può leggere, infatti: „il rene é uno dei maggiori siti di tossicità indotta da farmaci dato che riceve circa il 25% della gittata cardiaca ed é un luogo di significativa escrezione. Solo circa il 7% dei farmaci fallisce a causa della sua nefrotossicità i test pre-clinici su colture di cellule 2D e modelli animali, mentre é stimato che circa il 30-50% dei casi di acuta insufficienza renale nei pazienti siano dovuti a nefrotossicità indotta dai farmaci. Gli attuali metodi di test pre-clinici non sono abbastanza rigorosi per predire la risposta umana alla maggior parte dei farmaci“.

Le colture cellulari 2D „hanno il vantaggio di essere molto semplici, e poco costose. Tuttavia […] sono incapaci di ricapitolare la complessità del contesto in-vivo e hanno dimostrato spesso per indurre una risposta tossica di richiedere dosi maggiori e su periodi di tempo più lunghi rispetto alle reazioni di tossicità in-vivo sul paziente“. I modelli animali, invece, „offrono il vantaggio di un sistema complesso che si perde con le colture cellulari 2D. Tuttavia, la biologia animale differisce per molti aspetti da quella umana a causa delle differenze fisiologiche ed ambientali, rendendoli così in grado di prevedere le risposte umane solo in una certa misura. Oltretutto i test su, ad esempio, i roditori, vengono effettuati un gran numero di volte e con animali „altamente ordinati con gli stessi background genetici, età, fattori ambientali e stati di malattia“. Queste condizioni non possono venir riprodotte e controllate nell’uomo, soprattutto nelle prime fasi cliniche. A questo va aggiunto che „nel caso di nefrotossicità indotta da farmaci, le persone più sensibili sono quelle con condizioni renali insufficienti o quelle già in trattamento con farmaci nefrotossici. Queste persone non vengono normalmente incluse negli studi clinici e così la loro risposta si saprà solo quando verranno trattati con un farmaco approvato“.

„Le bioingegnerie dei tessuti con cellule umane rifletteranno meglio la situazione nei pazienti, in quanto consentiranno test di tossicità acuta anche per periodi di esposizione più lunghi. Questo darà la possibilità di rilevare lesioni cumulative dei tessuti con una somministrazione ripetuta di diverse concentrazioni subtossiche, una situazione più rilevante per la pratica clinica. Inoltre, i tessuti 3D sottoposti a esposizioni dei composti possono essere usati per rilevare biomarcatori indicativi di nefrotossicità in-vivo, consentendo così la traslazione dalla situazione in-vitro a quella in-vivo“. 

„Qui descriviamo un sistema di tessuto renale umano 3D bioingegnerizzato e la sua valutazione come predittore della nefrotossicità umana.

Il tessuto bioingegnerizzato è funzionalmente e morfologicamente simile al tessuto di rene umano in vivo. Il trattamento del tessuto con nefrotossici noti ha mostrato che il tessuto 3D era più sensibile a concentrazioni di farmaco inferiori rispetto alle stesse cellule coltivate in 2D. Inoltre, studi a lungo termine hanno rivelato l’utilità maggiore del modello 3D per studi di tossicità cronica rispetto al sistema 2D.“

„Il tasso di successo incredibilmente basso dei farmaci che entrano nelle fasi cliniche, una migliore comprensione dei limiti delle colture cellulari 2D, e iniziative per ridurre il numero di animali utilizzati per testare i farmaci hanno portato ad una recente spinta allo sviluppo dei modelli di tessuto umano 3D per lo studio della tossicità. Si ipotizza che i modelli di tessuto umano 3D potranno meglio ricapitolare la risposta in-vivo degli umani ai farmaci. Abbiamo caratterizzato un nuovo ed unico modello 3D del tessuto renale umano bioingegnerizzato ed applicato per la sperimentazione sulla nefrotossicità indotta da farmaci in confronto alle colture cellulari 2D. Abbiamo dimostrato che il modello di tessuto 3D ha una diversa tempistica di induzione della tossicità rispetto alle colture 2D ed é più sensibile al dosaggio del farmaco, avendo valori più bassi di DL50. Inoltre, abbiamo dimostrato l’utilità di questo modello per i test di tossicità cronica ed esaminato la rilevanza di marcatori pre-clinici per monitorare la tossicità in 3D.

Precedenti modelli 2D di nefrotossicità hanno fatto affidamento su cellule primarie del tubulo prossimale. Presumibilmente ciò consente, in termini di espressione genica, il monitoraggio della tossicità in una cellula molto vicina allo stato in-vivo. Tuttavia le cellule primarie non sono una fonte costantemente rinnovabile, richiedendo un re-isolamento da altri pazienti a causa della loro incapacità di proliferare durante numerosi passaggi e subiscono relativamente veloci cambiamenti dell’espressione genica dopo la crescita in-vitro. Per superare questo problema, il descritto tessuto renale umano 3D bioingegnerizzato é composto da cellule epiteliali renali umane hTERT immortalizzate originarie principalmente del tubulo prossimale. È stato dimostrato che le cellule immortalizzate perdono l’espressione dei trasportatori degli anioni organici e altre proteine rispetto alle cellule primarie,
alterando potenzialmente la loro idoneità per i test tossicologici. Tuttavia, l’utilizzo di cellule immortalizzate nella tossicologia fornirebbe costanza genetica rispetto alla variabilità insita utilizzando cellule primarie di pazienti differenti e permetterebbe la produzione di una rinnovabile e stabile serie di cellule per testare differenti stati di malattia. L’immortalizzazione delle cellule epiteliali renali umane hTERT ha dimostrato di non avere un effetto significativo sulla loro funzione e nei nostri studi abbiamo dimostrato che le nostre cellule epiteliali renali umani hTERT immortalizzate hanno più similitudini con la funzione renale in vivo nelle colture 3D che in quelle 2D, mantenendo l’espressione di OAT1 e OAT4, e rinnovando la trascrizione della mengalina quando cresciute come un tessuto 3D. Un ulteriore problema con l’uso di linee di cellule immortalizzate é la loro costante proliferazione che le rende inadatte per studi cronici a lungo termine. Ciò é evidente nei nostri dati nei quali l’LDH aumenta nel tempo nei modelli 2D senza trattamento farmacologico. Tuttavia, questo problema non era evidente nella coltura tissutale 3D. L’LDH non ha proliferato, distruggendo il tessuto bioingegnerizzato, anche dopo 8 settimane di coltura. Questo può essere il risultato di eventi di segnalazione tra l’ECM e le cellule o risultare dalla loro formazione in una struttura 3D. Ulteriori esami del modello 3D possono rilevare il motivo della senescenza apparente delle cellule in 3D rispetto al 2D e ulteriori ricerche sul meccanismo di tossicità dei farmaci dovrebbe fornire un‘ulteriore prova dell’utilità di cellule epiteliali renali immortalizzate per la sperimentazione dei farmaci in-vitro.

Uno dei modi migliori per valutare l’effetto tossico di un composto in un sistema e compararlo con altri sistemi è con un valore di DL50. I dati sulla tossicità nel nostro modello 3D hanno rivelato una diminuzione significativa della DL50 sia per la gentamicina che per la  doxorubicina rispetto a entrambe le nostre cellule NKi-2 in 2D e i valori per hRPTEC pubblicati in precedenza. Inoltre, mentre la DL50 era simile tra 3D e 2D, con valore più altro in 3D, entrambi i valori erano più bassi rispetto ai valori pubblicati per hRPTEC e cellule HK-2. Mentre è difficile dimostrare la rilevanza di questo in-vivo, precedenti studi sulla tossicità della gentamicina in 2D hanno dimostrato che sono necessari dosi estremamente alte e un periodo prolungato è necessario per ottenere la massima tossicità rispetto a quanto richiesto nei pazienti. Presi insieme, stanno ad indicare che il nostro modello 3D bioingegnerizzato è più sensibile rispetto alle cellule 2D e hRPTEC.”

“Diversamente da test di lesioni renali in-vivo che possono esaminare i livelli di creatinina sierica, i test in-vitro sono limitati da marcatori non specifici della morte cellulare come LDH o, nel caso del rene, marcatori specifici di lesioni cellule epiteliali renali come Kim-1 e NGAL. Per meglio rilevare l’utilità del nostro modello 3D bioingegnerizzato per i test dei farmaci pre-clinici, abbiamo guardato la secrezione di questi biomarcatori pre-clinici. L’utilizzo di questi biomarcatori in vitro deve essere limitato poiché la NGAL ha dimostrato di essere sovraregolata sulla preparazione prossimale delle cellule del tubulo e Kim-1 non può venir adeguatamente espressa nelle colture di cellule 2D. Le nostre colture di cellule 2D esprimono livelli significativamente più alti di Kim-1 rispetto ai tessuti in 3D. Quando questo viene combinato con i nostri dati, viene suggerito che le cellule possono comportarsi più come le loro omologhe in-vivo se hanno la possibilità di formare una struttura 3D. Inoltre, la perdita di cellule vitali all’interno del sistema modello a causa dell’alta tossicità era evidente dalla perdita dell’espressione di Kim-1. La possibilità di usare biomarcatori pre-clinici con i costrutti dei tessuti renali umani 3D indica sia la loro somiglianza con i tessuti in-vivo che la loro utilità per futuri studi sulla nefrotossicità.

Abbiamo dimostrato la fattibilità di un modello 3D del tessuto renale umano e che questo può venir utilizzato negli studi pre-clinici dei farmaci con biomarcatori approvati. Mentre l’uso di modelli 3D per la nefrotossicità é stato studiato utilizzando tubuli di topo in idrogel, questo é il primo modello in grado non solo di guardare le funzioni delle cellule epiteliali renali umane, ma anche di essere applicato per gli studi sulla nefrotossicità. Questo modello ha il potenziale per limitare la quantità di animali negli studi pre-clinici e può dare migliori informazioni riguardo il dosaggio nei pazienti.

Ulteriori studi per esaminare l’espressione dei trasportatori e gli enzimi che metabolizzano i farmaci e il meccanismo d’azione dei farmaci nelle cellule, in un modello 3D serviranno a validare meglio il sistema e a rivelare la sua idoneità per lo studio dei meccanismi di tossicità dei farmaci.“

 

[1] http://www.fda.gov/scienceresearch/specialtopics/criticalpathinitiative/default.htm

[Teresa M. DesRochers, Laura Suter, Adrian Roth, David L. Kaplan. Bioengineered 3D Human Kidney Tissue, a Platform for the Determination of Nephrotoxicity. PLoS One. 2013; 8(3): e59219. PMCID: PMC3597621.]

Abstract: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23516613 

Full text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3597621/pdf/pone.0059219.pdf

Figure 7

[S.P.]

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