Bioreattori Multi-Compartimentali Modulari (McmB)

Il MCMB è un sistema innovativo per colture cellulari dinamiche e co-colture. La camera modulare è progettata con forma e dimensioni simili al sistema di pozzetti multipli 24-MultiWell, e consiste di una camera di coltura cellulare in polimero di silicio. Le camere modulari possono essere collegate anche loro in serie o in parallelo, come desiderato, al fine di replicare le comunicazioni tessuto/tessuto e tessuto/organi e di ricreare modelli in vitro di metabolismo o malattie utilizzando l’approccio organomico. In linea con il concetto dell’Organomica, infatti, questo sistema offre stimoli meccanici dal flusso e stimoli biochimici dalle cellule poste in moduli collegati.

 

Quasi-Vivo®:

Il sistema Kirkstall Quasi-Vivo® consente di coltivare più tipi di cellule in camere di coltura interconnesse. Il flusso di sostanze nutritive tra le camere permette di simulare diverse vie metaboliche per indagare e testare modelli biologici multi-compartimentali in vitro.

Tradizionalmente, i sistemi di coltura cellulare statici che utilizzano pozzetti o piastre di Petri sono stati usati per rappresentare la fisiologia umana o animale. Tuttavia, vi è un crescente consenso sul fatto che tali modelli 2D siano poveri e inadeguati predittori della risposta in vivo (1, 2). Le cellule sono sensibili al loro microambiente, che è ricco di spunti 3D dalla matrice extracellulare, da altre cellule e da stimoli meccanici/chimici dovuti a flusso, gradienti di concentrazione e movimento. I metodi tradizionali per indagare le risposte cellulari in vitro non sono sufficienti in questo senso, in quanto la complessa interazione di fattori meccanici e biochimici è in gran parte assente.

Quando si utilizza una coltura 3D è importante fornire la perfusione dei nutrienti e l’ossigeno per sostenere le cellule e mantenere la corretta competenza metabolica. L’approccio di Quasi-Vivo® realizza tutto questo fornendo un flusso in un sistema a tenuta, che, per la costruzione modulare delle camere, consente ai modelli pluritessutali di essere interconnessi, condividendo mezzi di nutrizione e facilitando così la segnalazione da cellula a cellula. Le cellule possono essere coltivate su un’ampia varietà di supporti o addirittura di coprioggetti rivestiti.

Il sistema permette ai biologi cellulari che hanno familiarità con l’utilizzo di piastre multi-pozzetto per colture cellulari statiche di progettare esperimenti che siano più fisiologicamente significativi. Abbiamo articoli peer reviewed che confermano i benefici della coltura cellulare 3D sotto flusso nel sistema di Quasi-Vivo® (3). La competenza metabolica è migliorata offrendo un percorso per i modelli più complessi di malattia e di epigenetica che corrispondono ai risultati clinici (2). I test che utilizzano il sistema di Quasi-Vivo® hanno già dimostrato una migliore correlazione ai risultati della sperimentazione clinica rispetto ai precedenti in metodi di coltura cellulare in vitro (Risultati pubblicati come poster a Roma all’incontro AAT del 2009).

Un gran numero di sistemi di bioreattori per colture cellulari sono stati progettati e descritti (4-9). Nella maggior parte dei casi, i bioreattori descritti sono progettati su misura per esigenze specifiche e richiedono l’uso di particolari metodi di semina o ponteggi con specificazioni strettamente dimensionali e di design, limitando il loro utilizzo per ampia parte della comunità di ricerca. Possono variare di dimensione da fegati bioartificiali in larga scala con diversi miliardi di cellule e diversi ml di liquido fino a sistemi microfluidici che permettono la coltura di diversi tipi di cellule in un ambiente con sforzo di taglio controllato con poche centinaia di microlitri di media (10). In un micro bioreattore, la superficie della coltura cellulare è generalmente di circa 0,5 – 0.8mm2 (11) e questa superficie minuscola è seminata con poche migliaia di cellule. Tale piccolo numero di cellule, organizzato su una superficie molto piccola può essere solo una approssimazione di un organo e non può predire significativamente la fisiologia o la fisiopatologia in vivo (12). Un altro problema dei micro bioreattori è che la percentuale di area vicino al bordo del sistema è superiore in una superficie di dimensioni millimetriche. Una grande frazione della popolazione cellulare si ritrova in una zona periferica del sistema dove ha elevate tensioni citoscheletriche (13), e può anche avere diversa vitalità o attività (14). Quindi vi è una necessità di sistemi che superino questi problemi e forniscano uno scopo generale nel sistema di coltura cellulare in vitro per un’ampia varietà di tipi cellulari in una scala che consenta l’accurata modellazione del comportamento clinico umano in risposta ai farmaci o nella modellazione della malattia.

Gli epatociti sono i principali orchestratori del metabolismo e rappresentano il punto di partenza per la maggior parte dei modelli di organi, tuttavia, nei precedenti bioreattori, gli epatociti primari si sono rivelati difficili da mantenere in vitro in quanto perdono la loro capacità di metabolizzare i farmaci a causa della sotto-regolazione dei geni (in particolare i CYP) responsabili della fase I del metabolismo dopo tre giorni. Vinci et al (3) hanno valutato l’effetto di portata media in 21 giorni (fino a 500 uL / ​​min) su 32 diversi geni. Utilizzando il sistema Quasi-Vivo® hanno scoperto che l’espressione di mRNA di geni coinvolti nel metabolismo di xenobiotici/farmaci e nel trasporto in colture di 2 settimane ha raggiunto livelli vicini o superiori a quelli misurati in epatociti appena isolati dimostrando l’importanza del flusso nel mantenimento delle colture cellulari in uno stato simile a quello in vivo.

Applicazioni:

Il sistema Quasi-Vivo può essere usato per molte applicazioni bio-farmaceutiche:

– Lo sviluppo di farmaci:

Uno screen di formulazione altamente conveniente e preciso prima dei trial clinici umani.

– Medicina rigenerativa:

L’avanzato ambiente di coltura dei tessuti permette una più rapida crescita di tessuto fisiologicamente più accurato per produrre ad esempio la cartilagine o il tessuto cardiaco.

– Screening di sicurezza e di tossicità:

La coltura a più camere interconnesse dei diversi tipi cellulari permette la segnalazione cellula-cellula fornendo un modello fisiologicamente più accurato di risposta infiammatoria o immunitaria rispetto alle cellule cresciute in piastre multi-pozzetto. Anche le colture di epatociti possono essere collegate a cellule provenienti da tessuti bersaglio per misurare la tossicità dei metaboliti.

– Studi ADME:

Gli epatociti nel sistema hanno dimostrato di mantenere la loro capacità metabolica per almeno 28 giorni, rispetto a poche ore di epatociti primari appena isolati.

– Modelli di malattie:

Modelli in vitro di malattie, come il glaucoma o l’ipertensione, possono essere creati all’interno del sistema grazie a pressioni o flussi di tensioni da applicare al tessuto coltivato.

– Ricerca sulle cellule staminali:

Le condizioni di coltura possono essere regolate e modulate in modo accurato e riproducibile dando un migliore controllo sul lignaggio, controllando il fenotipo che la cellula staminale adotta.

I principi di design di Quasi-Vivo® si basano sulla scala allometrica del numero delle cellule e sui tempi medi di residenza delle molecole nei tessuti metabolici, così come sulla considerazione della tensione di ossigeno e dello sforzo di taglio, che possono essere combinati insieme per stabilire modelli di organi e di sis
temi. Collegando insieme diverse camere in serie o in parallelo, è possibile simulare diverse vie metaboliche e testare modelli biologici multi-compartimentali in vitro, senza dover progettare apparecchiature o camere di coltura dedicate (15).

Combinato con la scalatura allometrica, il sistema Quasi-Vivo® potrebbe anche trovare applicazioni nei seguenti modelli metabolici:

biotrasformazione (epatociti)

scambio di gas e di biotrasformazione (epatociti, cellule polmonari ed epiteliali)

assorbimento e biotrasformazione (epatociti, epiteli di pelle)

assorbimento dei nutrienti e biotrasformazione (epatociti, cellule epiteliali intestinali)

biotrasformazione e trasporto di nutrienti (epatociti, cellule endoteliali)

biotrasformazione, trasporto dei nutrienti e assorbimento dei nutrienti (epatociti, cellule endoteliali, cellule epiteliali intestinali).

Image of Quasi-Vivo Cell Culture Chambers Linked in Series

Un modello in vitro di diabete:

Colture connesse di epatociti, adipociti e cellule endoteliali dell’MCMB sono state usate per studiare la regolazione del metabolismo sistemico in vitro. Il sistema è stato progettato utilizzando una scala allometrica, concentrandosi sulla trasformazione del glucosio e dei lipidi per la loro rilevanza sul diabete e sui disturbi metabolici. Sono state riportate indagini sul ruolo del tessuto adiposo e sugli effetti dell’iperglicemia, simulando il diabete di tipo I e di tipo II nel modello sistemico (15, 19). I risultati mostrano che, anche se gli epatociti sono il principale regolatore, tutti e 3 i tipi di cellule sono necessari per ottenere una regolazione simil-omeostatica dei metaboliti. Specificamente, come nel contesto in vivo, abbiamo osservato:

– Inibizione della lipolisi e maggiore assorbimento di glucosio in presenza di insulina

– Lo stress vascolare (E-selectina) è significativamente aumentato in presenza di elevate concentrazioni di glucosio

– La sollecitazione sistemica (IL-6) è notevolmente aumentata in elevate concentrazioni di glucosio solo quando l’insulina è assente.

Utilizzo nel campo delle 3R: Replacement (Sostituzione)

Saggi 3D:

I saggi 3D basati su cellule hanno dimostrato di avere maggiore correlazione con la fisiologia umana rispetto ad alcuni modelli in vivo (16, 18). Il loro potenziale di sostituzione dei modelli animali potrebbe essere manifestato in diversi modi:

  • Sostituzione/riduzione dell’uso di animali per la previsione della tossicità negli esseri umani: una vasta gamma di tossicità umana (cardio-, epato-, immuno-, nefro-, neuro-, ecc) può essere modellata utilizzando cellule e tessuti umani all’interno del 3DKUBE ™, una nuova piattaforma di coltura cellulare 3D. L’applicazione di questi strumenti per identificare rapidamente composti tossici nella scoperta e nello sviluppo di farmaci ridurrà il numero dei candidati che entreranno nelle fasi successive.

  • Sostituzione/riduzione dell’uso di animali per la previsione della tossicità negli animali: una grande varietà di cellule e tessuti di origine animale può essere coltivata all’interno della 3DKUBE ™ per modellare la fisiologia animale, e potrebbe competere con la valutazione di tossicità in vivo. Questo porterebbe ad una sostituzione o a un’ampia riduzione dell’uso degli animali nelle industrie veterinarie e farmaceutiche, permettendo confronti interspecie.

  • Sostituzione/riduzione dell’uso di animali per la modellazione/efficacia di malattie: è possibile modellare un particolare stato di malattia combinando specifiche cellule umane o combinazioni di tessuto più accuratamente in un ambiente di coltura perfuso 3DKUBE ™ rispetto a un animale o a una coltura statica 2D. Queste colture possono essere convenientemente esposte ed analizzate istologicamente o mediante saggi biochimici. Ciò offre l’opportunità di sostituire gli animali attualmente utilizzati per stabilire l’efficacia di composti nell’uomo.

Bioreattori multi-compartimentali:

– L’utilizzo del sistema Quasi-Vivo® per i test di epatotossicità, tossicità multi-organo e metabolismo nello sviluppo dei farmaci ridurrà la necessità di studi in vivo, in particolare su candidati farmaci destinati a fallire in seguito nello sviluppo. L’utilizzo di questo sistema di test di tossicità ha anche un più ampio potenziale nell’ambito chimico e nell’industria dei prodotti di consumo.

– Potenziale sostituzione di modelli animali in molte applicazioni, ad esempio, nell’uso di roditori nella fase iniziale di screening di tossicità dei farmaci.

– Le cellule primarie umane che rappresentano più accuratamente la situazione in vivo, utilizzando il sistema di Quasi-Vivo®, potrebbero potenzialmente sostituire l’uso di animali nei successivi stadi di prove precliniche.

– Diversi tipi di cellule provenienti da un singolo donatore possono essere utilizzati in esperimenti multipli.

Le applicazioni riguardano la necessità di migliori strumenti per la previsione della tossicità dei farmaci utilizzando cellule primarie umane o linee cellulari prima degli studi clinici umani come parte del processo di scoperta e sviluppo di farmaci.

Inizialmente è probabile che questi test dovranno essere eseguiti in parallelo con i test sugli animali che sono ancora obbligatori ai sensi della normativa vigente. Tuttavia, nel lungo termine, crescendo la fiducia nelle nuove tecniche, si spera che i regolamenti possano essere cambiati. Questo potrebbe quindi avere un impatto importante sul numero di animali utilizzati una volta che questi nuovi test in vitro fossero accettati come un metodo per evitare la necessità di studi su animali.

Referenze:

(1) Zhang S. Beyond the petri dish. Nat Biotechnol 2004; 22(2):151-152,

(2)  Kirkpatrick J, Fuchs S, Hermanns I et al. Cell culture models of higher complexity in tissue engineering and regenerative medicine, Biomaterials 2007; 28(34):5193-5198

(3) Bruna Vinci, Cédric Duret, Sylvie Klieber, Sabine Gerbal-Chaloin, Antonio Sa-Cunha, Sylvain Laporte, Bertrand Suc, Patrick Maurel, Arti Ahluwalia and Martine Daujat-Chavanieu. Modular bioreactor for primary human hepatocyte culture: Medium flow stimulates expression and activity of detoxification genes, Biotechnol. J. 2011, 6, 554–564

(4) Dumont K, Yperman J, Verbeken E, Segers P, Meuris B.. Design of a new pulsatile bioreactor for tissue engineered aortic heart valve formation. Artif Organs 2002, 26:710–714

(5) Fu Q, Wu C, Shen Y, Zheng S, Chen R, Effect of LIMK2 RNAi on reorganisation of actin cytoskeleton in osteoblasts induced by fluid sheer stress. J Biomech 2008; 41(5): 3225 – 3228

(6) Martin I, Wendt D, Heberer M.. The role of bioreactors in tissue engineering. Trends Biotechnol 2004; 22:80–86

(7) Miyakawa A, Dallan LAO,
Lacchini S, Borin TF, Krieger JE.. Human saphenous vein organ culture under controlled hemodynamic conditions. Clinics 2008; 63(5):683–688

(8) Morelli S, Salerno S, Rende M, Lopez LC, Favia P, Procino A, Memoli B, Andreucci VE, d’Agostino R, Drioli E, De Bartolo L. Human hepatocyte functions in galactosylated membrane bioreactor, J Membr Sci 2007; 302: 27 – 35

(9) Powers MJ, Domandsky K, Kaazempur-Mofrad MR, Kalezi A, Capitano A, Upadhyaya A, Kurzawski P, Wack KE, Stolz DB, Kamm R, Griffith LG. A microfabricated array bioreactor for perfused 3D liver culture. Biotechnol Bioeng 2002a; 78:257–269

(10) De Bartolo L, Jarosch-Von Schweder G, Haverich A, Bader A. A novel full-scale flat membrane bioreactor utilizing porcine hepatocytes: Cell viability and tissue-specific functions. Biotechnol Prog 2000; 16(1):102–108

(11) Baudoin R, Corlu A, Griscom L, Legallais CE. Trends in the development of microfluidic cell biochips for in vitro hepatotoxicity. Toxicol In Vitro 2007; 21:535–544

(12) Tingley SK.. High-throughput cell culture: A real-world evaluation. Innovat Pharm Technol 2006; February:54–58

(13) McBeath R, Pirone DM, Nelson CM, Bhadriraju K, Chen CS. Cell shape, cytoskeletal tension, and RhoA regulate stem cell lineage commitment. Dev Cell 2004, 6(4):483–495

(14) Francis K, Palsson BO. Effective intercellular communication distances are determined by the relative time constants for cyto/chemokine secretion and diffusion. Proc Natl Acad Sci USA 1997; 94:12258–12262

(15) Mazzei D, Guzzardi MA, Giusti S, Ahluwalia A. A Low shear stress modular bioreactor for connected cell culture under high flow rates. Biotechnol Bioeng. 2010;106(1):127-37

(16)   Ridky, T.W., et al., Invasive three-dimensional organotypic neoplasia from multiple normal human epithelia. Nat Med. 16(12): p. 1450-1455.

(17)   With respect to a) differentiation, b) drug metabolism, c) expression (gene, protein), d) cell function, e) morphology, f) proliferation, g) stimulus response and h) viability, a minimum of ten references supporting each can be found athttp://www.3dcellculture.com/Just_The_Facts_3D_vs_2D_Cell_Culture

(18)   With respect to 3D models having a higher relevance than 2D culture to the in vivo state, nine references can be found athttp://www.3dcellculture.com/Just_The_Facts_3D_vs_2D_Cell_Culture

(19)   Iori E, Vinci B, Murphy E, Marescotti MC, Avogaro A., Ahluwalia A. (2012) Glucose and Fatty Acid Metabolism in a 3 Tissue In-Vitro Model Challenged with Normo- and Hyperglycaemia. PLoS One 7(4): e34704. doi:10.1371/journal.pone.0034704.

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