Guida alla sperimentazione animale FOR DUMMIES (e non vi offendete!)

In questa sede commenteremo uno scritto del gruppo pro-SA “Pro-Test Italia”, “Guida alla Sperimentazione Animale per tutti”, riprendendo i vari errori che vi sono contenuti.

Iniziamo subito citando dall’articolo dei pro:
“Per prima cosa, dovete sapere che, sì, è vero, la percentuale di farmaci che vengono rigettati prima della sperimentazione sugli uomini è alta… Ma non perché gli studi siano inattendibili, semplicemente perché la selezione è dura e ha molti passaggi.”
Questa però è una contraddizione in termini, perchè la selezione è dura? Semplicemente perchè nella maggior parte delle volte il risultato ottenuto in fase preclinica non è traslabile all’uomo.

Qui stanno i motivi per cui le colture cellulari sono insufficienti. Infatti, quando tu assumi un farmaco, questo deve entrare nel sangue, e sarà il sangue a portarlo alla sua destinazione finale. Ma il sangue arriva ovunque nel corpo. Prima di tutto, arriva al fegato, che può modificarne la struttura chimica, rendendolo, appunto, più attivo, più inattivo o tossico… Ed io naturalmente ho bisogno di sapere come il fegato lo trasformerà, perché in base a questo posso sistemare io stessa la struttura chimica del farmaco, aggiungendo o togliendo qualcosa, di modo che il farmaco passi il fegato attivo e non tossico. Inoltre, quello che può fare bene ad un organo o a una cellula potenzialmente può far male ad un altro… Questo è il motivo degli effetti collaterali. […] Ora, io ti chiedo: come fai a studiare tutto questo senza il sangue, senza il fegato, senza le barriere e senza i reni collegati con l’organo target?” 
Se il problema è raggiungere altri organi, può essere risolto grazie alle co-colture o ai bioreattori multi-compartimentali.
Un esempio del primo caso è costituito dalle Co-colture Integrate Discrete Multiorgano (IdMOC), che sono dei nuovi sistema sperimentali in vitro che permettono la valutazione degli effetti biologici di sostanze chimiche, con interazioni tra più tipi di cellule tra cui interazioni endocrine, paracrine e metaboliche. Un’applicazione specifica della IdMOC è la valutazione delle proprietà chimiche dipendenti dal metabolismo, come la tossicità e la farmacologia dipendenti dal metabolismo. 
Come già detto, infatti, le proprietà in vivo che non sono ben rappresentate in vitro includono risposte organo-specifiche, metabolismo di più organi, e interazioni tra più organi. Il sistema IdMOC è stato sviluppato proprio per affrontare queste carenze. Il sistema utilizza un concetto ‘wells-within-a-well’ per la co-coltura di cellule o fette di tessuto di diversi organi come entità fisicamente separate (discrete) nei pozzetti interiori. Questi pozzi interni sono comunque interconnessi (integrati) mediante coltura sovrastante. Il sistema ldMOC modella così la situazione in vivo, in cui più organi sono fisicamente separati ma interconnessi dalla circolazione sistemica, permettendo interazioni multiple di organi.
Per quanto riguarda invece i bioreattori multi-compartimentali modulari (McmB), si tratta di sistemi innovativi per colture cellulari dinamici e co-colture. La camera modulare è progettata con forma e dimensioni simili al sistema di pozzetti multipli 24-MultiWell, e consiste di una camera di coltura cellulare in polimero di silicio. Le camere modulari possono essere collegate anche loro in serie o in parallelo, come desiderato, al fine di replicare le comunicazioni tessuto/tessuto e tessuto/organi e di ricreare modelli in vitro di metabolismo o malattie utilizzando l’approccio organomico.
Un esempio di McmB è rappresentato da Quasi-Vivo®, un sistema che consente di coltivare più tipi di cellule in camere di coltura interconnesse. Il flusso di sostanze nutritive tra le camere permette di simulare diverse vie metaboliche per indagare e testare modelli biologici multi-compartimentali in vitro.

E allora perché riteniamo attendibili i risultati sulle cavie? Be’, perché in realtà a ben guardare le somiglianze sono più delle differenze.”
Ciò tuttavia non corrisponde al vero, infatti, per fare un esempio, nonostante abbiamo in comune il 98-99% del nostro DNA con lo scimpanzè (la specie geneticamente più vicina a noi), questa differenza dell’1-2% diventa un 80% di discordanza nel passaggio da geni a proteine. [Glazko G, Veeramachaneni V, Nei M, Makałowski W. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene. 2005 Feb 14;346:215-9.]

Questo si ricollega alla successiva affermazione dei pro-SA:
“Per la verità, moltissimi fenomeni nel topo avvengono in modo straordinariamente simile a come avvengono negli esseri umani…”
Infatti una somiglianza superficiale non tiene conto delle infinite differenze che vi possono essere a livello di proteine, metabolismo, permeabilità intestinale, anatomia, ecc.

E questo perché,a dispetto di quel che sembra dire l’aspetto,evolutivamente parlando siamo molto vicini”
Peccato che l’evoluzione non comporti solo somiglianze, anzi! Cito infatti da
Lynch VJ. Use with caution: developmental systems divergence and potential pitfalls of animal models. Yale J Biol Med. 2009 Jun;82(2):53-66. :
[…] l’ipotesi che le funzioni geniche e i sistemi genetici siano conservati tra i modelli e gli esseri umani è data per scontata, spesso a dispetto di prove che le funzioni e le reti geniche divergono nel corso dell’evoluzione. In questa recensione, discuto alcuni meccanismi che generano divergenza funzionale e metto in evidenza esempi recenti che dimostrano che le funzioni geniche e le reti di regolazione divergono nel tempo. Questi esempi suggeriscono che l’annotazione di funzioni geniche basate esclusivamente su fenotipi mutanti nei modelli animali, così come le assunzioni di funzioni conservate tra le specie, possono essere sbagliate. Pertanto, i modelli animali di funzioni geniche e di malattie umane non possono fornire informazioni adeguate, in particolare per la rapida evoluzione di geni e sistemi.” 

Nuovamente i pro-SA affermano:
Chiariamo ora un altro punto: il genoma non c’entra niente. O meglio: per infilarcelo bisogna prendere l’argomento molto alla lontana. Infatti, il genoma non è altro che l’insieme dei geni di una specie.In pratica, si tratta di una sorta di libretto di istruzioni per far funzionarel a cellula e l’organismo. I geni sono le parole del libretto di istruzioni,formati da delle lettere che sono i nucleotidi: adenina, timina,citosina e guanina. Ma, appunto, è solo un libretto di istruzioni: per quanto importante,non è lui che svolge i vari compiti all’interno della cellula. In una cellula sono le proteine che agiscono per svolgere un compito, e il genomaserve per sapere come costruirle.”
Infatti, come già detto, differiamo a livello proteico dallo scimpanzè, la specie geneticamente più vicina a noi, per ben l’80%, immaginiamo quanto può essere ampia la differenza con un topo o un ratto!
Tuttavia è indubbio che differenze a livello genetico spesso si traducano in differenze a livello funzionale, pertanto l’argomento non è da scartare, e sempre in questo campo, vi sono fattori che rendono gli animali ancora più diversi da noi, tra cui: la possibile perdita o acquisizione di determinati geni durante l’evoluzione, l’alterazione di geni o cromosomi, le differenze rispetto alle forme di uno stesso gene, la presenza di pseudogeni (geni che hanno perso la loro funzione nel corso dell’evoluzione), trasferimento genico orizzontale, splicing alternativo, a
cquisizione di nuove funzioni da parte di vecchi geni, diversità di geni per svolgere la stessa funzione, regolazione ed espressione di geni in modo diverso in relazione agli stimoli ambientali, influssi epigenetici e miRNA, differenze nelle reti di regolazione genica, cambiamento dei profili di espressione genica, differenze rispetto alle proteine, alla loro attività o alla loro interazione; differenze per quanto riguarda l’esposizione ai fattori ambientali e diversa storia evolutiva.

La maggior parte delle malattie per cui prendiamo farmaci non c’entrano poi granché col DNA perché vengono dall’esterno(da virus e batteri) o da stili di vita errati (come molte cardiopatie, ad esempio) o da incidenti di vario tipo. Ora, pensare di testare un farmaco per questi tipi di fenomeni solo con esperimenti di tossicogenomica è quantomeno miope.”
In primis, la tossicogenomica cerca di collegare cambiamenti indotti nell’espressione genica con le classi di composti tossici, non è solo l’analisi delle predisposizioni genetiche alle malattie come sembra voler far intendere l’autore dell’articolo.
Inoltre questo metodo, nella sostituzione dell’animale, non deve rimanere isolato, ma venire integrato con altre metodologie in modo da poter dare un quadro completo della situazione.

Infine, mi aspetto la domanda: ma non si può prendere cellule umane di ogni organo e testare su quelle l’effetto che avrebbe il farmaco, di modo da non dover somministrare il farmaco all’individuo per vedere l’effetto su fegato, reni etc. etc.? Ni. Cioè, si può fare… Ma non è esaustivo.Infatti, le cellule si parlano tra loro. Si scambiano ioni e neurotrasmettitori(un esempio sono i neuroni), ormoni, cibo, molecole segnale… Questi sono messaggi in codice. Le cellule di un organismo pluricellulare non sono entità separate le une dalle altre, autosufficienti e che si fanno i fatti loro: le cellule collaborano tra loro per svolgere dei compiti, e se separate le une dalle altre non funzionano.”
Ed è proprio per questo che non si devono prendere colture isolate, bensì utilizzare co-colture o sistemi come i McmB che ricreino le interconnessioni tra le varie cellule e le interazioni organo-organo. 
Proprio in virtù di questo principio, il Wyss Institute di Harvard, uno dei massimi centri di bioingegneria del mondo, sta spendendo ingenti somme per lo sviluppo di Organ-on-a-chip, chip microfluidici che simulano l’attività, la risposta meccanica e la fisiologia di organi o sistemi, al fine di ricreare un vero e proprio “Body-on-a-chip”, nel quale tutti gli organi sono interconnessi al fine di simulare correttamente e completamente l’intero range delle risposte possibili da parte di un organismo umano.
In aggiunta, se, come dimostrato dallo studio MEIC, eseguito per verificare la capacità predittiva delle colture cellulari rispetto agli animali nei test di tossicità sulla base di alcuni dati noti di tossicità di alcune sostanze sull’uomo, una batteria di tre saggi su colture di cellule umane è maggiormente predittiva, economica e pratica degli studi condotti su animali, l’utilizzo di queste nuove tecnologie, l’uso di modelli tridimensionali e la replica in vitro delle interazioni organo-organo sicuramente aumenterebbero la predittività degli studi preclinici.

E quindi? Dobbiamo arrenderci? No. Bisogna continuare a cercare metodi alternativi.”
Certo, se poi però certi metodi aspettano la validazione da anni, se si validano i nuovi test partendo dai modelli animali mai validati piuttosto che con meta-analisi retrospettive, se ci si concentra su fantomatici metodi alternativi con le cellule epidermiche di topo (http://www.eurekalert.org/pub_releases/2013-03/acs-ntf032713.php) e se gli enti atti alla validazione impiegano 10 anni per ogni metodologia da valutare, allora non avremo mai un cambiamento reale, a dispetto ovviamente della salute e della sicurezza dei volontari umani.

Al momento il più promettente di questi metodi teorizzati sono le “colture organo tipiche”.In pratica, ad oggi si prende un organo, si fanno delle fettine e si cerca di farlo sopravvivere fuori dal corpo, così da potervi agire per le sperimentazioni…però si è teorizzato che magari un giorno si potrebbe tentare di far crescere direttamente questo tessuto a partire dalle cellule staminali tipiche di quel tessuto stesso, quindi senza prendere l’organo da un animale.”
In primo luogo, il più promettente per chi e secondo quale principio?
In secondo luogo, non è necessario l’uso di animali, basta fare una breve ricerca su pubmed scrivendo “human organotypic culture” e ci si accorge che ve ne sono tantissime che utilizzano tessuti umani, certamente è un settore da sviluppare, ma non con l’uso di modelli o derivati animali, dato che si andrebbe comunque a ricadere nell’errore di utilizzare un modello non-predittivo per l’uomo.

Comunque le staminali dovranno essere prese da un animale. Magari da uno anziché da più d’uno, ecco.”
Perchè mai? Le cellule staminali pluripotenti indotte possono essere prese anche da esseri umani senza problemi e le cellule staminali embrionali sarebbero molto utili, inoltre, considerato che molti embrioni vengono congelati e sono destinati a morire nei congelatori, il problema etico neanche si pone. In questo senso, sarebbe opportuna una collaborazione tra pro- e anti-SA nella legalizzazione della ricerca su embrioni umani.

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