Metodi Alternativi: Chi? Cosa? Perchè?

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Le recenti prese di posizione dei sostenitori della sperimentazione animale non possono lasciare indifferente la parte della comunità scientifica e accademica contraria a tale metodo di ricerca. Si apre finalmente una possibilità di dibattito, una possibilità di informare l’opinione pubblica sulla fallacia del sopracitato metodo.

Premettendo che non siamo contrari ai modelli animali per motivi etici, ma bensì per le pressoché inesistenti basi scientifiche degli stessi, chiediamo a chi di dovere di supportare  e quindi validare finalmente metodi sostitutivi più predittivi per l’uomo, incentrati su di esso e in sua funzione creati. La validazione deve avvenire per metodologie che tengano conto dei dati umani, non animali: ad esempio per quello che riguarda i modelli matematici, estremamente sensibili e in ogni caso non in grado, singolarmente, di sostitutire altri metodi di ricerca, é pressoché ridicola la taratura su dati animali e non umani.

Lo stesso processo di validazione è sbagliato, comparare infatti i dati di un metodo alternativo con quelli di un modello mai validato, come l’animale, può darci risultati fuorvianti sulle potenzialità della metodologia che si sta valutando. Non a caso, nella sostituzione del Draize Test, vi è stata la necessità di rieffettuare una validazione, non per colpa dei metodi sostitutivi, ma per i falsi positivi che il Draize test stesso tendeva a dare [1]. Infatti il Cytosensor Microphysiometer, che doveva sostituirlo, diede un risultato inizialmente inconcludente, dato che lo si confrontò con quello del Draize test, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive [2], che pertanto richiediamo diventino il sistema di validazione standard.  

Ogni giorno materiale umano di scarto, quale quello proveniente da biopsie o autopsie, viene gettato, quando potrebbe apportare un validissmo aiuto alla ricerca. A ciò si aggiunge l’alto numero di embrioni umani, provenienti da fecondazioni in vitro/artificiali, che potrebbero, previa una dettagliata regolamentazione, essere utilizzati.

Le relativamente recenti scoperte della bioingegneria potrebbero finalmente essere in grado di riprodurre in laboratorio tessuti o organi umani creati da cellule umane. I Bioreattori Multi-Compartimentali Modulari (MCMB) sono dei sistemi innovativi per colture cellulari dinamiche e co-colture, che tramite diverse camere modulari collegate tra loro, in serie o in parallelo, possono essere in grado di replicare le interazioni organo-organo.

Il sistema Kirkstall Quasi-Vivo® ne é un esempio, consentendo di coltivare più tipi di cellule in camere di coltura interconnesse e di permettere la simulazione di diverse vie metaboliche, tramite un flusso di sostanze nutritive tra le camere, per indagare e testare modelli biologici multi-compartimentali in vitro.  Tra le applicazioni bio-farmaceutiche riportiamo: sviluppo di farmaci, medicina rigenerativa, screening di sicurezza e tossicità, studi ADME, modelli di malattie e ricerca sulle cellulle staminali. [22]

La Co-coltura Integrata Discreta Multiorgano (IdMOC) è un nuovo sistema sperimentale in vitro che permette la valutazione degli effetti biologici di sostanze chimiche, con interazioni tra più tipi di cellule tra cui interazioni endocrine, paracrine e metaboliche. Il sistema utilizza un concetto ‘wells-within-a-well’ per la co-coltura di cellule o fette di tessuto di diversi organi come entità fisicamente separate (discrete) nei pozzetti interiori. Questi pozzi interni sono comunque interconnessi (integrati) mediante coltura sovrastante media nella grande caldaia contenente pozzi. Il sistema ldMOC modella così la situazione in vivo, in cui più organi sono fisicamente separati ma interconnessi dalla circolazione sistemica, permettendo interazioni multiple di organi. 
Un’applicazione specifica della IdMOC è la valutazione delle proprietà chimiche dipendenti dal metabolismo, come la tossicità e la farmacologia dipendenti dal metabolismo. [23]

Il sistema 3DKUBE ™, una nuova piattaforma di coltura cellulare 3D, permette di modellare una vasta gamma di tossicità umana utilizzando cellule e tessuti umani. Ulteriore utilizzo è la modellazione, tramite cellule e tessuti di origine animale, della fisiologia animale, che porterebbe ad una sostituzione o a un’ampia riduzione dell’uso degli animali nelle industrie veterinarie e farmaceutiche, permettendo confronti interspecie.

La nefrotossicità rimane difficilmente prevedibile, sia negli studi preclinici che in quelli clinici. „I correnti metodi pre-clinici per determinare la tossicità renale includono le colture di cellule 2D e i modelli animali, entrambi non in grado completamente di ricapitolare la risposta umana in-vivo ai farmaci, contribuendo al tasso di fallimento delle fasi di sperimentazione clinica.“ Anche in questo caso quindi, „i tessuti 3D sottoposti a esposizioni dei composti possono essere usati per rilevare biomarcatori indicativi di nefrotossicità in-vivo, consentendo così la traslazione dalla situazione in-vitro a quella in-vivo“.  [3]

I modelli di coltura in vitro che utilizzano cellule di fegato umano potrebbero essere potenti strumenti per studi predittivi sulla tossicità dei farmaci e sul metabolismo nell’industria farmaceutica. Un modello di coltura di bioreattore è stato sviluppato che consente la co-coltura tridimensionale di cellule epatiche sotto continua perfusione media con scambio di massa decentrata e ossigenazione integrale. Abbiamo testato la capacità del sistema di supportare il mantenimento a lungo termine e la differenziazione delle cellule epatiche umane primarie. […]Vari metodi di coltura di epatociti sono stati stabiliti, prevalentemente basati su cellule animali, per studiare le vie metaboliche di farmaci e i meccanismi di epatotossicità (per una rassegna, vedi 1, 2). Tuttavia, i dati provenienti da modelli di cellule animali sono soggetti ad alcune limitazioni rispetto al loro valore clinico. E’ stato chiaramente dimostrato che marcate variazioni interspecie esistono nelle attività del CYP450 (3), e che le differenze di specie osservate in vivo possono essere riprodotte nei modelli di coltura cellulare (4, 5).“ [4]

La teratogenicità dei farmaci è attualmente difficilmente prevedibile a causa della misera attendibilità dei modelli animali [5]. Anche qui una combinazione di modelli matematici e in vitro (utilizzando preferibilmente cellule embrionali umane e non animali come detto nell’articolo) possono dare un supporto alla ricerca [6].

La problematica di maggiore portata per quanto riguarda i trapianti sono le reazioni immunitarie individuali e il meccanismo del rigetto. L’animale non sempre é in grado di prevedere le risposte immunologiche umane, si stanno perciò elaborando e studiando diversi metodi alternativi, come ad esempio i saggi di diluizione limite, l’ELISpot e la citometria a flusso. [7]

A questi si aggiungono metodologie in vitro che usano le cellule T per prevedere il rigetto o la tolleranza ai trapianti [8, 9, 10].

I microarray, utili anch’essi nell’ambito sia immunologico che proprio dei trapianti, “can provide nonbiased, simultaneous global expression patterns for more than 40,000 human genes across different experiments. High throughput microarray technology offers a means to study disease-specific transcriptional changes in tissue biopsy, peripheral blood, and biofluids.” [11].

Per quanto riguarda invece i modelli matematici, il modello iniziale viene sviluppato sulla base del virus HCMV (herpes virus), al fine di semplificarlo e facilitarne la dimostrazione della fattibilità.

Il modello si basa su una serie di eq
uazioni differenziali ordinarie (ODE) in grado di denotare, tramite delle variabili, l’efficacia dei farmaci antivirali e immunosoppressori. Tramite studi di simulazione vi é poi la possibilità di verificare che il modello produce risultati simili a quelli osservati nei rapporti clinici. 

L’effettiva fattibilità del controllo dell’immunodepressione post trapianto viene basata sull’MPC (model predictive control), un algoritmo che rappresenta i comportamenti di sistemi dinamici complessi. Il passo successivo sarà quello di riassumere i risultati della simulazione e dell’algoritmo e quindi la creazione di un modello, che usa dati umani, per gli esseri umani [12]. 

Un modello in vitro, denominato “MIMIC” (Modular IMmune In vitro Construct), è stato progettato e sviluppato per riflettere il sistema immunitario umano in un formato basato su pozzetti. Il sistema MIMIC è una metodologia basata sul laboratorio che replica la risposta del sistema immunitario umano. E’ altamente automatizzato, e può essere utilizzato per simulare un test clinico per una popolazione eterogenea, senza mettere a rischio soggetti umani. Il Sistema MIMIC utilizza le cellule immunitarie circolanti di singoli donatori per ricapitolare ogni risposta individuale immunitaria umana, mantenendo l’autonomia del donatore. Così, un sistema di test in vitro è stato creato che è funzionalmente equivalente al sistema immunitario del donatore ed è progettato per rispondere in maniera simile alla risposta in vivo [24].

Grazie alla bioingegneria, si potrebbe finalmente porre la parola fine al rigetto nei trapianti, utilizzando a questo scopo organi creati in laboratorio attraverso le cellule staminali del paziente stesso, coltivandole su strutture tridimensionali in materiale sintetico oppure stampate grazie a stampanti 3D (in corso).

E proprio a queste biostampati si è interessato anche il gruppo Autodesk che ha recentemente iniziato una collaborazione con Organovo Inc. al fine di sviluppare un nuovo sofware. [13]

A proposito di modelli computazionali e matematici, citiamo quello recentemente sviluppato dal Centro di Calcolo Nazionale Svizzero in collaborazione con il Cardiocentro Ticino, in grado di prevedere difetti cardiaci in un paziente partendo dai dati raccolti su di esso. [14]

La biocompatibilità di dispositivi medici (pacemaker, protesi, ecc.), ovvero l’attitudine di questi materiali ad essere ben tollerati dall’organismo ospite in cui devono operare e a determinare una risposta opportuna, potrebbe essere studiata utilizzando test in vitro per compatibilità cellulare (citotossicità) e compatibilità con il sangue (emocompatibilità), in modo da evitare pericoli per i pazienti e inutili esperimenti su animali.
Il sangue umano, inoltre, è consigliato per i test in vitro a causa di differenze specie-specifiche significative nella reattività del sangue, ad esempio adesione piastrinica, trombosi ed emolisi tendono ad accadere più prontamente nelle specie canine che negli umani.
I risultati ottenuti utilizzando questa metodologia sono inoltre maggiormente riproducibili e predittivi di quelli ottenuti da studi su animali. [15]

Nello studio dei tumori citiamo questa ricerca (in corso) del professor J. Greenman della “University of Hull“ che riguarda l’elaborarazione e l’ottimizzazione di un dispositivo a microfluidi per mantenere in vita cellule tumorali umane , da trattare con farmaci e testare con appropriate analisi tecniche. L’apparecchio potrà essere utilizzato sia dalle aziende farmaceutiche per ridurre e sostituire lo screening dei farmaci, sia dai medici come strumento per la personalizzazione delle strategie terapeutiche. [16]

Per quanto riguarda l’ambito delle neuroscienze cognitive, le reti neurali coinvolte nella maggior parte dei compiti cognitivi funzionano a livello di migliaia di neuroni, quindi non è necessario registrare dal singolo neurone per capire la funzione di un’area cerebrale. In questo caso ci vengono in aiuto le tecniche di neuroimaging su volontari umani, come la Tomografia ad emissione di positroni (PET), la Risonanza magnetica funzionale (fMRI), l’Elettroencefalogramma multicanale (EEG), la Tomografia ad emissione di fotone singolo (SPECT), la Magnetoencefalografia (MEG) e la spettroscopia ad infrarossi (NIRSI). Uno dei punti di forza dell’imaging e relativi metodi è che permettono una visione più globale e integrata del cervello umano. L’imaging permette anche di studiare alla risoluzione di alcuni millimetri e ci dà l’opportunità di analizzare la specie interessata, quella umana. I vantaggi scientifici dell’imaging umano sugli studi invasivi su primati includono la velocità: una scansione dura circa un’ora, mentre gli esperimenti su animali richiedono settimane. L’imaging ci dà informazioni sull’intero cervello e una visione più completa rispetto agli studi su animali sulla singola cellula. Gli umani sono inoltre capaci di inviare e comprendere informazioni verbali, il che rende i dati molto più ricchi rispetto alla mera informazione fisiologica proveniente dagli studi su primati, le cui interpretazioni richiedono illazioni e assunzioni che possono anche essere sbagliate.
Per gli studi dove le lesioni cerebrali sono ritenute necessarie per identificare la funzione di una parte del cervello, lesioni cerebrali temporanee possono essere create senza pericoli in volontari umani attraverso la stimolazione magnetica transcranica (TMS). Questa tecnica crea lesioni cerebrali momentanee e pienamente reversibili e può quindi rimpiazzare gli studi sulle lesioni nei primati dove la regione cerebrale di interesse è vicina alla superficie. [17]

Mentre attraverso la TMS è possibile inibire o stimolare la corteccia cerebrale in modo non invasivo, per le aree sottocorticali vi è la possibilità di utilizzare microstimolazioni elettriche di durata limitata e reversibili. Spesso lo si richiede a volontari che devono subire interventi di neurochirurgia, ad esempio pazienti affetti da Parkinson che vadano incontro a operazioni di stimolazione cerebrale profonda [18].

Un’affascinante tecnica usata con pazienti epilettici permette la registrazione proveniente da singoli neuroni in volontari umani. Pazienti con epilessia intrattabile talvolta si sottopongono a chirurgia elettiva per rimuovere le aree cerebrali colpite. Durante questo intervento il paziente è cosciente affinchè possa guidare il chirurgo, e alcuni volontariamente partecipano in studi che richiedono la registrazione di potenziali d’azione dal cervello [19]. In questo modo i ricercatori hanno intrapreso studi di elaborazione visiva per la memoria episodica usando registrazioni dirette dall’ippocampo e hanno scoperto che certi neuroni dell’ippocampo sono direttamente collegati alla memoria visiva [20].

Recentemente il Wyss Institute di Harvard uno dei massimi centri di bioingegneria del mondo, sta investendo grandi cifre per lo sviluppo di Organ-on-a-chip, chip microfluidici che simulano l’attività, la risposta meccanica e la fisiologia di organi o sistemi. Siccome i progressi significativi nella tecnologia focalizzata sugli Organ-on-a-chip continuano, è possibile prendere in considerazione il futuro di questa tecnologia. Con il serio lavoro svolto per realizzare il funzionamento di fegati, reni, cuore e polmoni artificiali su chip, il passo successivo è l’interconnessione di questi organi ricreando un „Body-on-a-chip“ al fine di simulare correttamente e completamente l’intero range delle risposte possibili da parte di un organismo umano. Vi è, inoltre, la possibilità di integrare la tecnologia delle cellule staminali per creare un Body-on-a-chip paziente-specifico [21].

Per concludere, sulla base delle seguenti informazioni, ci auspichiamo:

1. Che l’attuale iter di validazione venga sostituito completamente dalla validazione attraverso meta-analisi retrospettive, al fine di valutare in maniera migliore le reali potenzialità delle metodologie non-animali;
2. Che venga data maggiore attenzione ai metodi che non utilizzano derivati animali e ai potenziali replacement, al fine di ottenere nel minor tempo possibile metodologie più sicure per la tutela della salute umana;
3. Che vengano raccolti dati di esclusiva origine umana sui quali effettuare tali validazioni retrospettive;
4. Che i singoli Stati siano obbligati a valutare ed eventualmente a validare i potenziali metodi alternativi attraverso documentate prove d’efficacia presenti nella letteratura scientifica;
5. Che sia assegnato almeno il 50% dei fondi pubblici per la ricerca allo sviluppo di metodologie sostitutive agli attuali modelli preclinici e per la ricerca di base e traslazionale che li utilizza in sostituzione dei modelli in vivo;
6. Che sia dato agli enti deputati all’approvazione dei metodi alternativi minor tempo per la validazione degli stessi, al fine di accelerare il cambiamento verso una ricerca incentrata sull’uomo.

 

REFERENZE:

[1] Alan M. Goldberg, Thomas Hartung. Protecting More Than Animals. Scientific American 294, 84 – 91 (2006) doi:10.1038/scientificamerican0106-84 

[2] Hartung T, Bruner L, Curren R, Eskes C, Goldberg A, McNamee P, Scott L, Zuang V. First alternative method validated by a retrospective weight-of-evidence approach to replace the Draize eye test for the identification of non-irritant substances for a defined applicability domain. ALTEX. 2010;27(1):43-51. 

[3] Teresa M. DesRochers, Laura Suter, Adrian Roth, David L. Kaplan. Bioengineered 3D Human Kidney Tissue, a Platform for the Determination of Nephrotoxicity. PLoS One. 2013; 8(3): e59219. PMCID: PMC3597621.

[4] Zeilinger K, Sauer IM, Pless G, Strobel C, Rudzitis J, Wang A, Nüssler AK, Grebe A, Mao L, Auth SH, Unger J, Neuhaus P, Gerlach JC.,  Three-dimensional co-culture of primary human liver cells in bioreactors for in vitro drug studies: effects of the initial cell quality on the long-term maintenance of hepatocyte-specific functions. Altern Lab Anim. 2002 Sep-Oct;30(5):525-38. PMID: 12405881.

[5] Jarrod Bailey, Andrew Knight, Jonathan Balcombe. The future of teratology research is in vitro. Biogenic Amines, Volume 19, Number 2, 2005 , pp. 97-145(49).

[6] Webster WS, Brown-Woodman PD, Ritchie HE. A review of the contribution of whole embryo culture to the determination of hazard and risk in teratogenicity testing. Int J Dev Biol. 1997 Apr;41(2):329-35. 

[7] Hernandez-Fuentes MP, Salama A. In vitro assays for immune monitoring in transplantation. Methods Mol Biol. 2006;333:269-90.

[8] Benítez F, Najafian N. Novel noninvasive assays to predict transplantation rejection and tolerance: enumeration of cytokine-producing alloreactive T cells. Clin Lab Med. 2008 Sep;28(3):365-73, v. doi: 10.1016/j.cll.2008.07.002.

[9] Canivet C, Böhler T, Galvani S, Péron JM, Muscari F, Alric L, Barange K, Salvayre R, Negre-Salvayre A, Durand D, Suc B, Izopet J, Thomsen M, Rostaing L, Kamar N. In vitro mitogen-stimulated T-cell from hepatitis C virus-positive liver transplantation candidates, increases T-cell activation markers and T-cell proliferation. Transpl Immunol. 2008 May;19(2):112-9. doi: 10.1016/j.trim.2008.03.001. Epub 2008 Apr 3.

[10] Ekong UD, Miller SD, O’Gorman MR. In vitro assays of allosensitization. Pediatr Transplant. 2009 Feb;13(1):25-34. doi: 10.1111/j.1399-3046.2008.01042.x. Epub 2008 Nov 12.

[11] Zarkhin V, Sarwal MM. Microarrays: monitoring for transplant tolerance and mechanistic insights. Clin Lab Med. 2008 Sep;28(3):385-410, vi. doi: 10.1016/j.cll.2008.08.003.

[12] Banks HT, Hu S, Jang T, Kwon HD. Modelling and optimal control of immune response of renal transplant recipients. J Biol Dyn. 2012;6(2):539-67. doi: 10.1080/17513758.2012.655328. Epub 2012 Feb 1.

[13] http://ir.organovo.com/news/press-releases/press-releases-details/2012/Organovo-Partners-With-Autodesk-Research-to-Develop-3D-Bioprinting-Software1132373/default.aspx

[14] Mark Potse, Rolf Krause, Angelo Auricchio. A supercomputer to understand the failing heart.
http://www.cscs.ch/newsroom/science/2012/a_supercomputer_to_understand_the_failing_heart/index.html

[15] Müller U. In vitro biocompatibility testing of biomaterials and medical devices. Med Device Technol. 2008 Mar-Apr;19(2):30, 32-4.

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[17] Langley, G and Harding, G and Hawkins, P and Jones, A and Newman, C and Swithenby, S and Thompson, D and Tofts, P and Walsh, V (2000) Volunteer studies replacing animal experiments in brain research – Report and recommendations of a Volunteers in Research and Testing workshop. ATLA, 28 (2) 315 – 331.

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