Bioreattori multicompartimentali, IdMOC e Organs-on-a-chip per sostituire la sperimentazione animale in farmacologia – parte II

Ringraziamenti

L’autore desidera ringraziare per la disponibilità e il permesso di utilizzare i materiali inclusi nelle figure: la Dr. Amanda Woodrooffe, Asterand Ltd, il Dr. Gordon Baxter, BioWisdom Ltd, i Dottori Albert Li e Aarti Uzgare, Advanced Pharmaceutical Sciences Inc., il Dr. Malcolm Wilkinson, Kirkstall Ltd, e il Dr. Rick Groleau, Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering Center for Life Sciences Boston. Un ringraziamento è dovuto anche a Kathy Archibald del Safer Medicines Trust e al Dr. Peter Fishman di Novartis Pharmaceuticals Corp. per gli utili consigli nella stesura di questo articolo.

Figura 1

Diagrammi di Venn di sostanze che causano effetti avversi nei fegati degli esseri umani, roditori, e / o nonroditori. (a) Il numero di composti che comportano effetti in ogni classe di specie: da sole e in più di una classe, e (b) con le percentuali di sostanze si evidenziano azioni sul fegato nell’uomo con effetti solo nell’uomo, negli esseri umani e nei roditori, negli esseri umani e nei nonroditori e infine in tutte le tre classi di specie, quali definite da affermazioni derivate da Medline per un totale di 1061 sostanze (vedi http://www.biowisdom.com/downloads/SIP_Board_Species_Concordance.pdf).

Figura 2

Confronto dei pattern di espressione QRT-PCR per 5-HT2B in 20 tessuti di topo (rosso) e umano (blu). Ogni braccio radiale numerato rappresenta un diverso tipo di tessuto, e i cerchi concentrici rappresentano entità di espressione genica in mRNA per numero di esemplari per 100 ng di RNA totale. I punti dei dati sono valori medi da 3 valori indipendenti (cioè generati da 3 campioni per ogni tipo di tessuto, ciascuno ottenuto da un animale / donatore separato). I tessuti sono (1) cuore, (2) esofago, (3) stomaco, (4) digiuno, (5) colon, (6) pancreas, (7) fegato, (8) cervelletto, (9) corteccia frontale, (10 ) midollo spinale, (11) trachea, (12) parenchima polmonare, (13) rene, (14) vescica, (15) ovaio, (16) utero, (17) deferenti, (18) testicolo, (19) milza , (20) pelle. (vedi Coleman, [26]).

Figura 3

Alcuni esempi di test che comportano co-colture cellulari. Tali metodi consentono l’applicazione simultanea di sostanze a più tipi di cellule, con il significato di studiare l’influenza (ad esempio, tramite fattori secreti) di un tipo di cellula sopra l’altro, e degli effetti di metaboliti prodotti da un tipo di cellula in funzione di un’altra. (a) tecnologia IdMOC. Tipicamente, le cellule vengono seminate in pozzetti interni (contrassegnati in verde) e incubate per 24 ore per permettere l’attaccamento, dopo di che il più grande, rettangolo (giallo), è invaso bene da terreni contenenti substrati o composti di prova. Il terreno che causa l’allagamento consente l’interconnessione di pozzi multipli all’ interno della cella mimando l’integrazione di più organi attraverso la circolazione sistemica. (b) Il pannello superiore mostra un sistema “quasi-vivo”: il pannello inferiore è una rappresentazione schematica di come le camere possono essere collegate in serie con differenti tipi di cellule in ciascuna. La prima camera A1 è una camera a flusso doppio con liquidi / terreni diversi su entrambi i lati di una membrana porosa o impalcatura su cui le cellule sono in coltura. Il tipo A1 di camera può essere atto a fornire una interfaccia aria-liquido sostituendo uno dei flussi liquidi per via aerea. (c) Lung su un chip. Un pannello superiore mostra i circuiti integrati, un pannello inferiore illustra schematicamente il particolare del disegno e la disposizione degli epiteliali bronchiali e delle vie respiratorie e dell’ endotelio vascolare in entrambi i lati di una membrana porosa. I chips sono dispositivi polimerici lunghi 2 cm. progettati per imitare la funzione di polmone umano. Il sistema di microfluidi incorpora un’interfaccia alveolo-capillare che è fiancheggiato da due camere laterali. L’interfaccia alveolo-capillare è costituita da una membrana flessibile e porosa, un polimero di 10 micron di spessore, rivestita con matrice extracellulare (ECM) che separa un canale contenente cellule epiteliali alveolari umani e uno strato di aria da un canale contenente cellule endoteliali microvascolari polmonari umane e uno strato scorrevole di colture cellulari. L’ applicazione del vuoto alle camere laterali deforma le pareti sottili che separano queste camere dall’interfaccia, causando l’ estensione della membrana polimerica flessibile così imitando gli effetti meccanici della respirazione.

Bibliografia

1.  Litchfield JT. Forecasting drug effects in man from studies in laboratory animals.Journal of the American Medical Association. 1961;177:34–38. [PubMed]
2.  Litchfield JT. Evaluation of the safety of new drugs by means of tests in animals.Clinical Pharmacology and Therapeutics. 1962;3(5):665–672. [PubMed]
3.  Fletcher AP. Drug safety tests and subsequent clinical experience. Journal of the Royal Society of Medicine. 1978;71(9):693–696. [PMC free article] [PubMed]
4.  Lumley CE, Walker SR, editors. CMR Workshop—Animal Toxicity Studies: Their Relevance for Man. Lancaster, UK: Quay; 1990.
5.  Zbinden G. Predictive value of animal studies in toxicology. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 1991;14(2):167–177. [PubMed]
6.  Olson H, Betton G, Robinson D, et al. Concordance of the toxicity of pharmaceuticals in humans and in animals. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 2000;32(1):56–67. [PubMed]
7.  Grass GM, Sinko PJ. Physiologically-based pharmacokinetic simulation modelling. Advanced Drug Delivery Reviews. 2002;54(3):433–451. [PubMed]
8.  Spanhaak S, Cook D, Barnes J, Reynolds J. Species concordance for liver injury. BioWisdom Report, 2009,http://www.biowisdom.com/downloads/SIP_Board_Species_Concordance.pdf.
9.  Mitchell P. Critics pan timid European response to TeGenero disaster. Nature Biotechnology. 2007;25(5):485–486. [PubMed]
10.  http://www.animalresearch.info.
11.  The use of non-human animals in research: a guide for scientists. The Royal Society. February 2004 , http://royalsociety.org/The-use-of-non-human-animals-in-research-a-guide-for-scientists.
12.  Animal research is a source of human compassion, not shame. Lancet.2004;364(9437):815–816. [PubMed]
13.  http://www.petratscanada.com/forbidden_foods.htm.
14.  http://www.wisegeek.com/which-foods-are-toxic-to-cats-and-dogs.htm.
15.  Suntharalingam G, Perry MR, Ward S, et al. Cytokine storm in a phase 1 trial of the anti-CD28 monoclonal antibody TGN1412. New England Journal of Medicine.2006;355(10):1018–1028. [PubMed]
16.  Schuh JCL. Trials, tribulations, and trends in tumor modeling in mice.Toxicologic Pathology. 2004;32(supplement 1):53–66. [PubMed]
17.  Sharpless NE, Depinho RA. The mighty mouse: genetically engineered mouse models in cancer drug development. Nature Reviews Drug Discovery.2006;5(9):741–754. [PubMed]
18.  Olive KP, Tuveson DA. The use of targeted mouse models for preclinical testing of novel cancer therapeutics. Clinical Cancer Research. 2006;12(18):5277–5287.[PubMed]
19.  Kung AL. Practices and pitfalls of mouse cancer models in drug discovery.Advances in Cancer Research. 2006;96:191–212. [PubMed]
20.  http://biopharmconsortium.com/blog/2010/04/15/developing-improved-mouse-models-of-cancer-for-drug-discovery-and-development.
21.  Kola I, Landis J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nature Reviews Drug Discovery. 2004;3(8):711–715. [PubMed]
22.  Coleman RA. Current animal models are not predictive for clinical asthma.Pulmonary Pharmacology and Therapeutics. 1999;12(2):87–89. [PubMed]
23.  Zosky GR, Sly PD. Animal models of asthma. Clinical and Experimental Allergy.2007;37(7):973–988. [PubMed]
24.  Krug N, Rabe KF. Animal models for human asthma: the perspective of a clinician. Current Drug Targets. 2008;9(6):438–442. [PubMed]
25.  http://www.homeoffice.gov.uk/science-research/animal-research.
26.  Coleman RA. Discovery today: the value of experiments on human tissues.Alternnative to Animal Testing Experiments. 2004;10(1):24–35.
27.  Manivet P, Schneider B, Smith JC, et al. The serotonin binding site of human and murine 5-HT2B receptors. Molecular modeling and site-directed mutagenesis.Journal of Biological Chemistry. 2002;277(19):17170–17178. [PubMed]
28.  Matthews RA. Medical progress depends on animal models—doesn’t it? Journal of the Royal Society of Medicine. 2008;101(2):95–98. [PMC free article] [PubMed]
29.  Lappin G, Garner RC. The utility of microdosing over the past 5 years. Expert Opinion on Drug Metabolism and Toxicology. 2008;4(12):1499–1506. [PubMed]
30.  Lappin G. Microdosing: current and the future. Bioanalysis. 2010;2(3):509–517.[PubMed]
31.  Wagner CC, Simpson M, Zeitlinger M, et al. A combined accelerator mass spectrometry-positron emission tomography human microdose study with 14C- and 11C-labelled verapamil. Clinical Pharmacokinetics. 2011;50(2):111–120.[PMC free article] [PubMed]
32.  Ritter J. January, 2006http://www.illinoisrighttolife.org/EthicalFrontier_ResearchOnTheDead.htm.
33.  Tomasini F. Research on the recently dead: an historical and ethical examination. British Medical Bulletin. 2008;85(1):7–16. [PubMed]
34. http://ec.europa.eu/environment/chemicals/reach/pdf/reach_animal_testing.pdf.
35.  http://www.opentox.org.
36.  Stebbings R, Findlay L, Edwards C, et al. “Cytokine storm” in the phase I trial of monoclonal antibody TGN1412: better understanding the causes to improve preclinical testing of immunotherapeutics. Journal of Immunology.2007;179(5):3325–3331. [PubMed]
37.  Findlay L, Eastwood D, Stebbings R, et al. Improved in vitro methods to predict the in vivo toxicity in man of therapeutic monoclonal antibodies including TGN1412. Journal of Immunological Methods. 2010;352(1-2):1–12. [PubMed]
38.  Russell WMS, Burch RL.http://altweb.jhsph.edu/pubs/books/humane_exp/het-toc.
39.  Ames BN, Lee FD, Durston WE. An improved bacterial test system for the detection and classification of mutagens and carcinogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1973;70(3):782–786.[PMC free article] [PubMed]
40.  Robinson V. Finding alternatives: an overview of the 3Rs and the use of animals in research. School Science Review. 2005;87:1–4.
41.  http://www.nc3rs.org.uk/category.asp?catID=73.
42.  http://www.alttox.org/ttrc/validation-ra/validated-ra-methods.html.
43.  Papa E, Pilutti P, Gramatica P. Prediction of PAH mutagenicity in human cells by QSAR classification. SAR and QSAR in Environmental Research. 2008;19(1-2):115–127. [PubMed]
44.  Holmes AM, Rudd JA, Tattersall FD, Aziz Q, Andrews PLR. Opportunities for the replacement of animals in the study of nausea and vomiting. British Journal of Pharmacology. 2009;157(6):865–880. [PMC free article] [PubMed]
45.  Baxter GT. Hurel—an in vivo-surrogate assay platform for cell-based studies.Alternatives to Laboratory Animals. 2009;37(supplement 1):11–18. [PubMed]
46.  Feng X, Du W, Luo Q, Liu BF. Microfluidic chip: next-generation platform for systems biology. Analytica Chimica Acta. 2009;650(1):83–97. [PubMed]
47.  Mazzei D, Guzzardi MA, Giusti S, Ahluwalia A. A low shear stress modular bioreactor for connected cell culture under high flow rates. Biotechnology and Bioengineering. 2010;106(1):127–137. [PubMed]
48.  Li AP. The use of the integrated discrete multiple organ co-culture (IdMOC) system for the evaluation of multiple organ toxicity. Alternatives to Laboratory Animals. 2009;37(4):377–385. [PubMed]
49.  Huh D, Matthews BD, Mammoto A, Montoya-Zavala M, Hsin HY, Ingber DE. Reconstituting organ-level lung functions on a chip. Science. 2010;328(5986):1662–1668. [PubMed]
50.  Pretzel D, Pohlers D, Weinert S, Kinne RW. In vitro model for the analysis of synovial fibroblast-mediated degradation of intact cartilage. Arthritis Research and Therapy. 2009;11(1, article R25) [PMC free article] [PubMed]
51.  Berg EL, Yang J, Melrose J, et al. Chemical target and pathway toxicity mechanisms defined in primary human cell systems. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 2010;61(1):3–15. [PubMed]
52.  Romanov S, Medvedev A, Gambarian M, et al. Homogeneous reporter system enables quantitative functional assessment of multiple transcription factors. Nature Methods. 2008;5(3):253–260. [PubMed]
53.  Wills Q, Mitchell C. Toxicogenomics in drug discovery and development—making an impact. Alternatives to Laboratory Animals. 2009;37(1):33–37.[PubMed]
54.  Elvidge S. Getting the Drug Repositioning Genie Out of the Bottle. Life Science Leader; 2010.
55.  Sundstrom L, Morrison B, Bradley M, Pringle A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 2005;10(14):993–1000.[PubMed]
56.  Cheng K, Lai Y, Kisaalita WS. Three-dimensional polymer scaffolds for high throughput cell-based assay systems. Biomaterials. 2008;29(18):2802–2812.[PubMed]
57.  Gidrol X, Fouqué B, Ghenim L, Haguet V, Picollet-D’hahan N, Schaack B. 2D and 3D cell microarrays in pharmacology. Current Opinion in Pharmacology.2009;9(5):664–668. [PubMed]
58.  Winkler J, Sotiriadou I, Chen S, Hescheler J, Sachinidis A. The potential of embryonic stem cells combined with -omics technologies as model systems for toxicology. Current Medicinal Chemistry. 2009;16(36):4814–4827. [PubMed]
59.  http://www.sc4sm.org.
60.  Peng S, Lacerda AE, Kirsch GE, Brown AM, Bruening-Wright A. The action potential and comparative pharmacology of stem cell-derived human cardiomyocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods.2010;61(3):277–286. [PubMed]
61.  Berg EL, Kunkel EJ, Hytopoulos E, Plavec I. Characterization of compound mechanisms and secondary activities by BioMAP analysis. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 2006;53(1):67–74. [PubMed]
62.  MacDonald ML, Lamerdin J, Owens S, et al. Identifying off-target effects and hidden phenotypes of drugs in human cells. Nature Chemical Biology.2006;2(6):329–337. [PubMed]
63.  Young DW, Bender A, Hoyt J, et al. Integrating high-content screening and ligand-target prediction to identify mechanism of action. Nature Chemical Biology.2008;4(1):59–68. [PubMed]
64.  http://www.epa.gov/comptox.
65.  http://www.organdonation.nhs.uk/ukt/statistics/statistics.jsp.

Bioreattori multicompartimentali, IdMOC e Organs-on-a-chip per sostituire la sperimentazione animale in farmacologia – parte I

Tessuti umani nella valutazione della sicurezza e dell’efficacia di nuovi farmaci: una valida alternativa ai modelli animali?

(Traduzione ad opera di Frasca Tra Tutti)

[Coleman RA. Human tissue in the evaluation of safety and efficacy of new medicines: a viable alternative to animal models? ISRN Pharm. 2011;2011:806789. doi: 10.5402/2011/806789. Epub 2011 Jul 6.]

Articolo originale: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3263708/

Abstract:

La capacità dell’industria farmaceutica di sviluppare nuovi farmaci sicuri ed efficaci da introdurre sul mercato è in grave declino. Probabilmente un importante contributo (a questo declino, NdT) è l’ampia dipendenza dell’industria nei confronti dei metodi di prova biologici non umani per determinare la sicurezza potenziale e l’efficacia di tali farmaci, la cui analisi oggettiva rivela scarso valore predittivo. Un ovvio approccio alternativo è quello di utilizzare i test su umani, ma solo se sono disponibili, pratici ed efficaci. Mentre le tecnologie in vivo (microdosaggi in fase 0 con la spettroscopia di massa ad alta sensibilità) e in silico (utilizzando dati biologici umani prestabiliti) sono sempre più utilizzate, gli approcci umani in vitro sono impiegati più raramente. Tuttavia non solo sono attualmente disponibili o in fase di sviluppo metodi di prova in vitro sempre più sofisticati, ma è stabilita l’infrastruttura (delle regole, NdT) di base eticamente riconosciute attraverso le quali possono essere adottate le cellule e i tessuti umani. Sia il microdosing clinico che i metodi in silico, con un accesso più ampio e l’uso di cellule e tessuti umani in vitro, offrono opportunità interessanti e potenzialmente più efficaci al fine di valutare la sicurezza e l’efficacia di nuovi farmaci.

1. Introduzione

E ‘generalmente accettato che l’industria farmaceutica ha un problema nell’immettere sul mercato nuovi farmaci sicuri ed efficaci. Questo potrebbe essere dovuto, almeno in parte, alla eccessiva fiducia del settore nell’utilizzare gli animali come surrogati umani, una questione che è stata fonte di preoccupazione per molti lavoratori del settore per decenni [1-6]. Infatti le specie animali più utilizzate, roditori, cani e persino primati non umani, hanno tutte dimostrato di essere inaffidabili nella capacità di prevedere il comportamento del farmaco nell’uomo. Un confronto di Grass e Sinko tra la biodisponibilità di una gamma di farmaci nell’uomo con queste tre specie ha dimostrato un pessimo livello di correlazione [7]. Inoltre, lo studio retrospettivo di Olson e coll. [6] ha dimostrato che, per alcuni sistemi, il valore predittivo di studi sugli animali per identificare la potenziale tossicità in soggetti umani ha poco più peso che il lancio di una moneta. È interessante notare che le scoperte di Olson correlano piuttosto bene con quelle di Fletcher [3], pubblicate più di 20 anni prima. Un ulteriore supporto è uno studio sulla concordanza fra specie per quanto riguarda il danno epatico [8] con un programma di intelligenza di sicurezza attingendo dati dal Medline e dall’ EMEA European Public Assessment Reports (EPAR).In una gamma di oltre 800 (Medline) e 130 (EPAR) composti, commercializzati e ritirati con evidenza di tossicità epatica nell’uomo, solo il 60% (Medline) e il 49% (EPAR) si sono dimostrati analogamente tossici nei roditori e solo il 17% e il 35% in specie da esperimento di tipo roditori e non roditori (Figura 1).Alla luce di tale discutibile potere predittivo, sembra sorprendente che tale commercio è ancora basato su dati relativi alla sicurezza animale. Anche se questo è sempre stato il modo di agire è stata espressa la preoccupazione che le carenze degli studi su animali sono destinate a diventare sempre più grandi con lo sviluppo di farmaci biologici umani mirati [9]. C’è una forte spinta, dunque, a guardare più criticamente i metodi attualmente utilizzati per valutare la potenziale sicurezza ed efficacia dei nuovi farmaci e di sperimentare se ci sono modi migliori per farlo.

2. Il ruolo degli animali nelle prove di sicurezza ed efficacia

E’ opinione ancora diffusa che, nonostante i loro noti limiti, gli studi su animali siano fondamentali per la scoperta di nuovi farmaci,ed è stato affermato che “virtualmente ogni conquista medica del secolo scorso è dipesa direttamente o indirettamente sulla ricerca con gli animali” [10-12].Nonostante una potente affermazione, è quella che ha una giustificazione falsa. A sostegno, per quanto riguarda la questione delle nuove medicine, è innegabile che tutti (i farmaci NdT) sono stati testati su animali e che questi test hanno dimostrato che le molecole sono sufficientemente sicure ed efficaci per essere valutati nell’uomo. Succede così perché l’industria richiede che i farmaci siano efficaci in modo dimostrabile nei loro modelli animali prima di portare avanti tali farmaci per la fase clinica. E per quanto riguarda la sicurezza, un aspetto obbligatorio del processo regolamentare di approvazione è un profilo sufficientemente sicuro in animali da esperimento. Così, se è vero che tutti i farmaci sono stati testati e giudicati sicuri ed efficaci negli animali, non è chiaro fino a che punto questo sia sicuro per i loro profili in soggetti umani. Infatti, se fosse stabilito che solo i composti colorati giallo o con odore di rose possono passare alla sperimentazione clinica, tutti i farmaci di successo avrebbero queste caratteristiche, ma sarebbe assurdo suggerire che queste proprietà siano essenziali per l’identificazione di nuovi medicinali sicuri ed efficaci. Quello che l’ attuale fede nelle previsioni animali ignora è in primo luogo il fatto che la grande maggioranza dei farmaci che entrano negli studi clinici potrebbero essere caratterizzati da mancanza di efficacia clinica o potrebbero causare  effetti collaterali o tossicità franca e in secondo luogo che non abbiamo idea di quanti farmaci potenzialmente preziosi sono stati gettati nella pattumiera, sulla base dei falsi dati sugli animali.

Per valutare in prospettiva il ruolo di modelli animali surrogati per la sicurezza umana, è interessante considerare che cosa accadrebbe se per l’approvazione dei prodotti alimentari per il consumo umano fosse richiesta una prova di sicurezza in animali da esperimento. Se così fosse, non avremmo avocado, formaggio gorgonzola, cavolini di Bruxelles, cavolo, cioccolato, caffè, aglio, uva, liquirizia, cipolle, o molti altri prodotti alimentari comuni e di cui è dimostrata la sicurezza [13, 14], in quanto tutti hanno dimostrato essere mal tollerati o addirittura tossici nei roditori e / o cani.  E più precisamente  la recente esperienza con il farmaco prodotto dalla ditta “Te Genero”, TGN1412 [15], che ha causato effetti devastanti in volontari umani ad una dose di 500 volte inferiore a quella ben tollerata dai primati non umani, dimostra le carenze della valutazione della sicurezza con animali, in particolare nel caso di agenti specificamente progettati per interagire con bersagli umani, come sono un numero crescente di nuovi farmaci biologici.

La situazione non è migliore per quanto riguarda le previsioni di efficacia. Il cancro è un ottimo esempio, dove i modelli dei topi abbondano ma hanno una pessima performance nel predire l’efficacia nell’uomo [16-19]. E ‘stato generalmente accettato che circa il 95% dei farmaci contro il cancro, efficaci in modelli animali, hanno dimostrato di essere inefficaci in clinica [20, 21]. E se si guarda l’attuale arsenale di trattamenti antiasmatici, principalmente corticosteroidi, beta-agonisti, teofillina, cromoni e antileucotrienici, solo in quest’ultima categoria di farmaci si può affermare che la scoperta originale e lo sviluppo della classe è basata su esperimenti su animali. Al contrario, se passiamo in rassegna i composti promossi come potenziali nuovi trattamenti per l’asma a base di studi effettuati su topi, cavie e pecore, vediamo, tra gli altri, antistaminici, antagonisti della neurochinina, della bradichinina, del PAF, del trombossano e dei recettori dell’endotelina, farmaci che bloccano i canali del calcio, farmaci che aprono i canali del potassio, statine e PPAR gamma-agonisti, nessuno dei quali si è dimostrato alla fine clinicamente utile [22-24].

Il ruolo del topo come surrogato umano sperimentale è aumentato notevolmente con il completamento (sequenziamento, NdT) dei genomi murino e umani e la dimostrazione della fondamentale somiglianza genomica delle due specie. Secondo le statistiche del “Home Office” nel 2008 nel Regno Unito sono stati utilizzati nelle procedure pianificate più di 2 milioni di topi e questi hanno rappresentato oltre il 60% del numero totale di animali utilizzati [25]. Uno studio dell’espressione genica nel topo e nell’ uomo rivela molte differenze critiche: per fare un esempio specifico è stato dimostrato che i pattern di espressione a livello fenotipico del recettore del mRNA per il 5-HT2B nelle due specie sono molto diverse [26] (Figura 2). Inoltre, vi è solo una concordanza del 82% nelle sequenze dei geni che codificano questo recettore in queste due specie [27]. E, cosa ancora più importante, uno studio dell’affinità di questo recettore per il suo ligando naturale, 5-HT, ha rivelato che l’avidità del recettore del topo per 5-HT è almeno 100 volte più bassa di quella del recettore umano per l’ormone [27]. Con una tale differenza, è inconcepibile che il recettore 5-HT2B in queste due specie serva per lo stesso ruolo.

Questo non vuol dire che tutti i test su animali siano privi di valore; per alcune classi di farmaci, particolari test sugli animali si sono dimostrati altamente predittivi dell’ efficacia clinica e / o della sicurezza. Tuttavia, questa non è palesemente una regola generale e la convalida o meno si ottiene solo con il senno di poi, fornendo un punto di partenza piuttosto insicuro per valutare molecole innovative. E ‘senza dubbio opportuno, quindi, mettere in discussione l’uso continuato di surrogati di animali su base sia etica che logica. Questo è il punto di vista sostenuto da un certo numero di pubblicazioni critiche, compresa quella di [28], che ha dimostrato che la probabilità di animali di predire l’esito clinico umano (di un farmaco, NdT) non era significativamente migliore di 50: 50. Quindi, se i risultati degli animali in questo senso sono così scarsi, perché noi continuiamo a usarli? Ci sono un certo numero di motivi, alcuni di questi relativi semplicemente al fatto che le cose sono sempre state fatte così, l’insistenza di coloro che stabiliscono le regole per i dati animali e naturalmente la difficoltà di trovare un’alternativa.

3. E’ possibile un’alternativa non-animale?

L’alternativa ovvia è quella di concentrarsi sulla biologia umana, piuttosto che non umana, nella sperimentazione preclinica. Ma come? I tre approcci disponibili allo scienziato per la scoperta di nuovi farmaci sono in vivo, in silico, e in vitro.

Sono state sviluppate un certo numero di tecniche non invasive per valutare in soggetti umani l’attività dei farmaci, come la TAC, MRI, PET e SPECT, la stimolazione magnetica transcranica (TMS) e laser Doppler imaging di perfusione, anche se non è chiara la validità di queste tecniche per determinare la sicurezza potenziale di nuovi farmaci. Tuttavia, vi è un crescente interesse per l’utilizzo di microdosaggi (ad esempio, la somministrazione di dosi circa 100 volte inferiori alla dose clinica più bassa prevista) e vi è un numero crescente di evidenze che abbia valore predittivo [29-31]. Non c’è dubbio che se verranno replicati i primi incoraggianti dati, questo approccio sarà utilizzato sempre di più in futuro, nelle valutazioni dei farmaci. Tuttavia, questo approccio è valido prevalentemente per esplorare il probabile destino farmacocinetico di nuovi farmaci e fornisce informazioni limitate per l’efficacia e la sicurezza anche se può fornire una prima indicazione della probabile generazione di metaboliti potenzialmente pericolosi o anche efficaci. È rilevante in questa fase parlare di test farmacologici in individui con morte cerebrale, un modello che è stato condotto continuativamente, anche se a bassi livelli per oltre 25 anni [32]. Questo approccio, che tecnicamente è da elogiare molto, permettendo in modo unico la generazione di dati di grande rilevanza, solleva una serie di questioni etiche, che sono al di là del campo di applicazione del presente lavoro, e che lascio ad altri da discutere [33] .

Al contrario, l’esecuzione di test in silico non solleva questioni etiche, e sta diventando sempre più accettata come una parte della valutazione preclinica del profilo di nuovi farmaci. L’uso dei test al silico, utilizzando approcci di calcolo, si sta mostrando promettente anche se al momento, è generalmente consigliato di utilizzare un consenso di indicatori da una varietà di modelli diversi, piuttosto che basarsi su un unico modello. Tuttavia, con molti modelli già disponibili in commercio, l’affidabilità di questo approccio per prevedere il comportamento di un farmaco nell’uomo indubbiamente crescerà, e come risulta dalla direttiva europea REACH [34], è ora sostenuto dal programma OpenTox [35]. Tuttavia, questo è sempre probabile che rimanga un elemento di supporto, piuttosto che un indicatore primario.

È chiaro che tali approcci in vivo e in silico sono sempre più accettati come fattori chiave per i programmi di sviluppo dei farmaci di oggi, e, come tali, non saranno trattati più avanti in questo articolo. L’argomento che realmente viene gravemente trascurato è l’uso di tecniche in vitro (su materiale NdT) umano. Il valore del metodo in vitro è ben illustrato da TGN1412, dove successivamente alla disastrosa sperimentazione clinica [15], è stato rapidamente sviluppato un metodo in vitro che ha creato un  modello potenzialmente fatale della tempesta di citochine vissuta dai volontari clinici [36, 37]. Se questo modello fosse stato sviluppato ed utilizzato prima di esporre soggetti umani al farmaco, il trial non sarebbe mai stato effettuato. Sicuramente, è giunto il momento che ci sia una valutazione prospettica rigorosa degli approcci basati sull’ uomo, non solo in vivo e in silico, ma in modo critico anche in vitro, come alternative agli approcci basati sugli animali profondamente viziati nell’ uso corrente per la identificazione di potenziali problemi di sicurezza per i nuovi farmaci nell’uomo.

3.1. Metodi umani basati sulla biologia

Nonostante l’affermazione nel 1959 del principio di Russell e Burch delle 3R [38], l’introduzione di test per la sicurezza di origine non animale è stata dolorosamente lenta e quella di test basati su materiale umano ancora più lenta. Non c’è stata fino al 1970, quando Ames et al. hanno introdotto il loro test di mutagenesi batterica [39], che fu il primo test di origine non animale per cui è stato promulgata  una disposizione normativa. Tuttavia, fino ad Ames, ci sono stati pochi altri test di origine non animale che hanno ottenuto l’accreditamento regolamentare e quelli che l’hanno avuto sono limitati in gran parte alla tossicità cutanea e a test di mutagenicità [40, 41]. Tuttavia, ci sono alcuni test su cellule/tessuti animali [42] che potrebbero in teoria utilizzare il materiale umano corrispondente alle prime, ma nel complesso, i test in vivo sugli animali restano la base della maggior parte dei test di sicurezza richiesti dalla normativa. È interessante notare che ora è stato sviluppato un test a base di cellule umane per sostituire il test di Ames [43], ma deve ancora essere concesso l’accreditamento normativo. Non è chiaro esattamente perché non viene effettuato uno sforzo maggiore per lo sviluppo di sistemi di test basati di più sugli umani, ma sembra essere una sorta di circolo vizioso, con l’industria e le autorità di regolamentazione in attesa l’uno con l’altro a fare la prima mossa. Ma ciò che è certo è che le autorità di regolamentazione approvano esclusivamente qualsiasi approccio solo quando vi è una convincente e valida dimostrazione, quindi è chiaramente sconveniente per l’industria raccogliere la sfida.

Può essere fatto notevole uso di cellule e tessuti umani isolati nel sostenere la R&S farmaceutica attraverso l’applicazione di analisi relativamente semplici in vitro, utilizzando le cellule del sangue, epatociti, isolotti pancreatici, e varie preparazioni muscolari lisce, ma una delle obiezioni principali all’adozione di modelli di tessuto in vitro umani è che è impossibile creare un modello che rispecchi adeguatamente la complessità del corpo intero in tessuti isolati. Mentre questo argomento ha indubbiamente una certa validità, è troppo facile dire semplicemente “non si può fare”, una posizione che sottovaluta gravemente l’ingegno umano di fronte ad un problema apparentemente irrisolvibile. Infatti, con lo sviluppo di nuove potenti tecnologie, tale modellizzazione può essere più vicina alla realizzazione di quanto generalmente creduto. La capacità degli scienziati di creare un modello di processi patologici complessi utilizzando una combinazione di semplici test è illustrato dal metodo apparentemente di successo di predire nausea e vomito nell’uomo utilizzando una serie di approcci, compreso l’uso di cellule umane [44]. La risposta è quasi certamente non solo nella valutazione delle azioni di farmaci in cellule in isolamento, ma anche attraverso l’integrazione di una serie di approcci tecnologici applicati ai tessuti e alle cellule umane in condizioni che riflettono meglio il rapporto cellula/cellula, tessuto/tessuto, e persino organo/interazioni fra organi che sono presenti nel corpo umano. Tali approcci integrati in vitro possono essere considerati come “prossimi al vivo”. Ci sono stati notevoli progressi nello sviluppo di tali modelli. Ciò è particolarmente importante in considerazione degli effetti non solo dei farmaci stessi, ma anche dei loro prodotti metabolici, e questi sono suscettibili di essere generati da tessuti diversi da quelli che sono bersaglio di un evento avverso. Tale sistema di modelli integrati viene presentato in una gamma di forme diverse (Figura 3), per esempio, utilizzando microfluidica [45, 46], il cosiddetto sistema multicompartimentale modulare quasi-vivo [47], o pozzetti entro pozzetti [48], i quali permettono che i farmaci siano esposti a tessuti chiave in modo prossimo a quello vivo. Tali strategie consentono ad esempio l’esposizione di un farmaco alle cellule epatiche prima del contatto con le cellule di un organo bersaglio, ciò consente di esaminare l’attività non solo del farmaco stesso, ma anche dei suoi prodotti metabolici, mimando di più quello che è probabile che si verifichi in vivo. Un impressionante esempio di questo approccio è il “polmone su un chip” sviluppato da scienziati di Harvard [49]. Se questo modello si riveletà utile, certamente finirà per essere sostituito da “gut on a chip”, “sistema cardiovascolare on a chip” e molti altri. Tale co-coltura è stata utilizzata anche per stabilire un modello di distruzione di cartilagine sinoviale indotta dai fibroblasti come un modello di artrite reumatoide [50].

Ci sono altri modi in cui le interazioni fisiopatologicamente rilevanti delle cellule possono essere rappresentate in un saggio in vitro. Un approccio interessante consiste nell’esporre combinazioni di tipi cellulari patologicamente rilevanti a varie problematiche diverse, e misurando il rilascio di un ampio gruppo di prodotti genici [51]. Questo ha dimostrato che il risultato dei test farmacologici su questo insieme di prodotti di rilascio può essere indicativo del meccanismo biologico di azione del composto in esame. L’uso di varie analisi di correlazione e clustering in confronto a un ampio insieme di riferimenti consente una notevole comprensione di entrambi gli aspetti, terapeutici e patologici, del profilo biologico dei nuovi composti. Simili approcci sono stati sviluppati da altre aziende, ma con altri marcatori di attività biologica, per esempio, l’espressione genica [52], fattori di trascrizione [53] e microRNA [54]. Tali tecnologie rappresentano approcci privi di ipotesi “a priori” più simili ai test di sicurezza in vivo che ai test tradizionali in vitro in cui un composto è comunemente saggiato contro un target particolare in un particolare tessuto o tipo di cellule.

Mentre i sistemi di coltura cellulare possono essere giustamente criticati per loro natura in generale non fisiologica, soprattutto per quanto riguarda il numero limitato di cellule, la perfusione inadeguata, e l’esistenza di “effetto-bordo”, su questo notevoli sforzi hanno determinato un miglioramento, con l’uso di sezioni di tessuto, scaffold e altri tipi di sostegno della cultura, e anche i metodi di coltura 3D [55-57]. La realizzazione di culture tridimensionali più fisiologiche, che coinvolgono combinazioni di tipi cellulari importanti, senza dubbio rappresenta un passo significativo verso una più efficace realizzazione in vitro di modelli di sistemi in vivo.

Un’altra importante fonte di materiale biologico umano è la cellula staminale. Poiché cresce la nostra comprensione delle cellule staminali e dei fattori che determinano la loro differenziazione, esse saranno senz’altro sempre più utili nella realizzazione di modelli per la sperimentazione di nuovi farmaci sia per valutarne l’efficacia che la tossicità [58]. E’ già in corso molto lavoro sotto l’egida del gruppo Stem Cells for Safer Medicines [59], il cui scopo dichiarato è quello di “consentire la creazione di una banca di cellule staminali, protocolli aperti e sistemi standardizzati nella tecnologia delle cellule staminali che permetteranno la costante differenziazione delle cellule staminali in popolazioni omogenee e stabili di particolari tipi di cellule, con fenotipi fisiologicamente rilevanti adatti per i test di tossicologia in piattaforme ad alto rendimento”. Infatti, ad esempio, le cellule staminali sono già state utilizzate per generare cellule simili ai cardiomiociti che possono essere utilizzate per realizzare modelli non solo della funzionalità del canale ionico cardiaco o del prolungamento dell’intervallo QT, ma con la potenzialità di indurre aritmie ventricolari associate a torsione di punta [60] .

Naturalmente il valore di ogni sistema di cellule e/o tessuti in vitro è tanto affidabile come i metodi tradizionali applicati per rilevare le attività dei farmaci. La risposta a una migliore valutazione degli effetti dei farmaci, sia in termini di potenziale efficacia e di sicurezza, risiede probabilmente in una associazione di adeguati sistemi di co-coltura con miglioramento dei metodi di tipo alto contenuto di rilevazione dell’attività biologica. Tali approcci, combinati con le moderne analisi di clustering e con software di pattern recognition, consentiranno l’identificazione di attività non rilevabili con i metodi in vitro più convenzionali [61-63]. Tali approcci sono attualmente incorporati nel programma ToxCast della US EPA, che è specificamente progettato per identificare i modi migliori di identificare la sicurezza delle persone, sia per le sostanze chimiche ambientali e, più recentemente, per i prodotti farmaceutici [64].

Non vi è alcuna intenzione di suggerire che al momento siamo in grado di passare in modo semplice dai correnti test di sicurezza, in gran parte con sistemi basati sugli animali, a una batteria di test più incentrati sugli umani. Ma, in funzione dei notevoli sviluppi fatti negli ultimi anni, l’onere ora è del settore biofarmaceutico e delle università per sfruttare la crescente gamma di tecnologie su tessuti umani al fine di sviluppare metodi più rilevanti e predittivi per stabilire la sicurezza e l’efficacia di nuovi farmaci, ma anche del governo e delle autorità di regolamentazione per fornire tutto il necessario incoraggiamento.

E’ altamente probabile che verranno rilevati effetti tossici e disturbi per i quali le cellule e i tessuti isolati non possono, e non potranno mai, fornire tutte le risposte, dove quindi il ricorso a animali da esperimento deve rimanere. In questi casi, tuttavia, dovrebbero essere intrapresi degli studi comparativi riguardanti cellule e tessuti con associati rilevanti processi fisiopatologici fra uomo e fra le specie animali prescelti per stabilire la rilevanza del modello animale proposto, prima che una risorsa preziosa sia potenzialmente sprecata nella semplice speranza che i risultati (su animali NdT) avranno rilevanza clinica.

4. Accesso a materiali biologici umani

Sebbene una attrattiva degli studi su umani in vitro è la vasta gamma di funzioni che possono essere studiate, si deve riconoscere che, se non migliora radicalmente il nostro approccio ai tessuti umani vitali, tali test rappresenteranno un notevole “collo di bottiglia” nei programmi dei test farmacologici preclinici. Attualmente, nel Regno Unito ci si limita quasi esclusivamente all’acquisizione di tessuti da un intervento chirurgico e post mortem. Sebbene i tessuti acquisiti da queste fonti siano di notevole valore, ciò non è sufficiente. Da queste fonti, siamo limitati in termini di varietà di tipi di tessuto, di quantità che può essere fornita, di qualità e di frequenza. Si tratta di questioni che devono essere affrontate se il tessuto umano mai diventerà una componente chiave di efficacia preclinica per i test di sicurezza. Vorrei suggerire che la risposta sta nel l’accesso ai tessuti da donatori di organi sia heartbeating (viventi NdT) che nonheartbeating (non viventi NdT). Nel solo Regno Unito, ci sono più di 17 milioni di persone attualmente sul registro dei donatori per trapianto, e nell’anno tra il 1 ° aprile 2009 e il 31 marzo 2010, sono stati eseguiti oltre 3.700 trapianti di organi [65]. Se ciascuno dei donatori di tali organi avesse donato organi e/o tessuti non trapiantabili per la ricerca, sarebbe stata possibile una grande quantità di ricerca basata sull’ uomo. E questo è potenzialmente solo la punta di un iceberg, in quanto il ministero della Sanità britannico sta cercando di aumentare la disponibilità di organi per il trapianto attraverso l’istituzione di “NHS Blood and Transplant”, e sarebbe estremamente utile se tutti i prelievi di organi per il trapianto potrebbero essere associati con il recupero aggiuntivo di materiale per la ricerca.

Ma la ricerca dei tessuti umani per essere adottata come una componente chiave dei test farmacologici, deve diventare un “bisogno di avere”, e che accadrà solo se essa si richiede come requisito normativo. Questo non accadrà fino a quando non saremo in grado di garantire l’accesso ai tessuti del tipo richiesto, in condizioni adeguate, in quantità sufficiente e con la frequenza necessaria. La collaborazione tra “NHS Blood and Transplant” e l’industria farmaceutica, con partecipazione da parte del pubblico per agevolare la disponibilità e l’uso di tessuti umani per la ricerca, è essenziale per realizzare il pieno potenziale di un approccio umano alla scoperta e allo sviluppo di farmaci.

Continua nella seconda parte

Differenze genetiche tra uomo e scimpanzè e impatto sulla ricerca su Alzheimer, diabete e cancro

[Fukuda K, Ichiyanagi K, Yamada Y, Go Y, Udono T, Wada S, Maeda T, Soejima H, Saitou N, Ito T, Sasaki H. Regional DNA methylation differences between humans and chimpanzees are associated with genetic changes, transcriptional divergence and disease genes. J Hum Genet. 2013 Jul;58(7):446-54.]

Full text: http://www.nature.com/jhg/journal/v58/n7/full/jhg201355a.html

Abstract:

Changes in gene expression have been proposed to have an important role in the evolutionary changes in phenotypes. Interspecific changes in gene expression can result not only from genetic changes in regulatory regions but also from epigenetic changes in such regions. Here we report the identification of genomic regions showing differences in DNA methylation between humans and chimpanzees (termed S-DMRs for species-specific differentially methylated regions) on chromosomes 21 and 22. These regional methylation differences are frequently associated with genes, including those relevant to a disease, such as Alzheimer’s disease, diabetes mellitus or cancer. Methylation differences are often correlated with changes in promoter activity or alternative splicing. Comparative studies including other great ape species provide evidence for the contribution of genetic changes to some of these S-DMRs. Genetic changes responsible for the S-DMRs include gain or loss of CTCF-binding site and changes in CpG density in microsatellite repeats. Our results suggest that DNA methylation changes, often caused by small sequence changes, contribute to transcriptional and phenotypic diversification in hominid evolution.

Modellare la sindrome di Barth grazie a cellule staminali e heart-on-a-chip

I ricercatori di Harvard soro riusciti a creare un rilevante modello in vitro della sindrome di Barth – una rara malattia, che colpisce principalmente bambini di sesso maschile, causata dalla mutazione di un gene (TAZ): essa ostacola la normale funzione metabolica delle cellule e porta nella maggioranza dei casi a gravi problemi cardiaci – utilizzando cellule staminali derivanti dai pazienti stessi e le tecnologie Organs-on-Chips.
Con il loro nuovo modello, i ricercatori sono riusciti a dimostrare che è sufficiente rilasciare i prodotti del gene TAZ non-mutato nel tessuto cardiaco malato per ripristinare le normali funzioni contrattili! Quello da loro creato è il primo modello basato su tessuti su cui si è riusciti a correggere una malattia genetica cardiaca!
Un grande passo in avanti per la medicina personalizzata. Il paper è stato pubblicato su Nature Medicine.

[Wang G, McCain ML, Yang L, et al. Modeling the mitochondrial cardiomyopathy of Barth syndrome with induced pluripotent stem cell and heart-on-chip technologies. Nature Medicine.Published online 11 May 2014.]

Link all’abstract: http://www.nature.com/nm/journal/vaop/ncurrent/full/nm.3545.html

Abstract:

Study of monogenic mitochondrial cardiomyopathies may yield insights into mitochondrial roles in cardiac development and disease. Here, we combined patient-derived and genetically engineered induced pluripotent stem cells (iPSCs) with tissue engineering to elucidate the pathophysiology underlying the cardiomyopathy of Barth syndrome (BTHS), a mitochondrial disorder caused by mutation of the gene encoding tafazzin (TAZ). Using BTHS iPSC-derived cardiomyocytes (iPSC-CMs), we defined metabolic, structural and functional abnormalities associated with TAZ mutation. BTHS iPSC-CMs assembled sparse and irregular sarcomeres, and engineered BTHS ‘heart-on-chip’ tissues contracted weakly. Gene replacement and genome editing demonstrated that TAZ mutation is necessary and sufficient for these phenotypes. Sarcomere assembly and myocardial contraction abnormalities occurred in the context of normal whole-cell ATP levels. Excess levels of reactive oxygen species mechanistically linked TAZ mutation to impaired cardiomyocyte function. Our study provides new insights into the pathogenesis of Barth syndrome, suggests new treatment strategies and advances iPSC-based in vitro modeling of cardiomyopathy.

 

Modello in vitro 3D di barriera epidermica di permeabilità funzionale da cellule staminali umane

[Petrova, A., Celli, A., Jacquet, L., Dafou, D., Crumrine, D., Hupe, M., Arno, M., Hobbs, C., Cvoro, A., Karagiannis, P., Devito, L., Sun, R., Adame, L., Vaughan, R., McGrath, J., Mauro, T., & Ilic, D. (2014). 3D In Vitro Model of a Functional Epidermal Permeability Barrier from Human Embryonic Stem Cells and Induced Pluripotent Stem Cells Stem Cell Reports DOI: 10.1016/j.stemcr.2014.03.009.]

Full text: http://www.cell.com/stem-cell-reports/pdf/S2213-6711(14)00088-5.pdf 

Abstract:

Highlights:

•Manufacture of HEEs with a functional epidermal barrier in vitro from hESCs/iPSCs
•Unique model for skin diseases with defective epidermal permeability barriers
•Easily adaptable model for use in regenerative and aesthetic medicine
•Cost-effective model for testing new drugs and cosmetics

Summary: 

Cornification and epidermal barrier defects are associated with a number of clinically diverse skin disorders. However, a suitable in vitro model for studying normal barrier function and barrier defects is still lacking. Here, we demonstrate the generation of human epidermal equivalents (HEEs) from human embryonic stem cells (hESCs) and induced pluripotent stem cells (iPSCs). HEEs are structurally similar to native epidermis, with a functional permeability barrier. We exposed a pure population of hESC/iPSC-derived keratinocytes, whose transcriptome corresponds to the gene signature of normal primary human keratinocytes (NHKs), to a sequential high-to-low humidity environment in an air/liquid interface culture. The resulting HEEs had all of the cellular strata of the human epidermis, with skin barrier properties similar to those of normal skin. Such HEEs generated from disease-specific iPSCs will be an invaluable tool not only for dissecting molecular mechanisms that lead to epidermal barrier defects but also for drug development and screening.