Archivi del mese: maggio 2015

IdMOC per sostituire gli animali in farmacologia, tossicologia, nell’ADMET e nello screening di farmaci anticancro

[Loganathan Gayathri, Dharumadurai Dhanasekaran, and Mohammad A. Akbarsha. Scientific concepts and applications of integrated discrete multiple organ co-culture technology. J Pharmacol Pharmacother. 2015 Apr-Jun; 6(2): 63–70.]

Full Text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4419250/

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Object name is JPP-6-63-g001.jpg

Abstract:

“Over several decades, animals have been used as models to investigate the human-specific drug toxicity, but the outcomes are not always reliably extrapolated to the humans in vivo. Appropriate in vitro human-based experimental system that includes in vivo parameters is required for the evaluation of multiple organ interaction, multiple organ/organ-specific toxicity, and metabolism of xenobiotic compounds to avoid the use of animals for toxicity testing. One such versatile in vitro technology in which human primary cells could be used is integrated discrete multiple organ co-culture (IdMOC). IdMOC system adopts wells-within-well concept that facilitates co-culture of cells from different organs in a discrete manner, separately in the respective media in the smaller inner wells which are then interconnected by an overlay of a universal medium in the large containing well. This novel in vitro approach mimics the in vivo situation to a great extent, and employs cells from multiple organs that are physically separated but interconnected by a medium that mimics the systemic circulation and provides for multiple organ interaction. Applications of IdMOC include assessment of multiple organ toxicity, drug distribution, organ-specific toxicity, screening of anticancer drugs, metabolic cytotoxicity, etc.

Conclusioni:

“The IdMOC technology is a simple and new-generation in vitro experimental system which does not require any sophisticated laboratory equipment for the evaluation of distribution, metabolism, and toxicity of a xenobiotic. Co-culture of multiple cell types of the same organ or multiple organs in a physically discrete manner allows the system to interact and helps to predict the multiple endpoints. Use of primary human cells and incorporation of metabolic cytotoxicity to the in vitro system provides an insight to the scientific community that IdMOC is a physiologically relevant model for risk assessment. The embodiment of wells-within-well concept in IdMOC technology has promoted in vitro technique from routine two-dimensional cell culture to mimic, to a great extent, the real in vivoconditions. Thus, IdMOC is an innovative and less time-consuming model that could replace animal testing methods perhaps to comply with the changing regulatory needs. In vitro approach has always been an adoptable technique and readily procures many in vivo key features. Thus, the technique could overcome the uncertainty of animal testing and withstand for a long period to reduce and replace the use of animals in scientific research. However, novel inventions and new methodologies will never stop until the in vitro condition matches or supersedes the in vivo condition. The future of cell culture could be the virtual human-on-chip which may simulate a complete human, but in a simple magnitude. IdMOC has a great potential simulating humans in vivo using in vitro conditions and this technique can be adopted by all researchers who are efficiently carrying out conventional in vitro cell culture in the laboratory.”

Sulle imprecisioni del discorso di Barré-Sinoussi al Parlamento Europeo

Durante l’audizione dell’iniziativa dei cittadini europei “Stop Vivisection” vi sono stati interventi da parte della dottoressa Françoise Barré-Sinoussi, che ha difeso la convinzione per cui gli animali sarebbero modelli predittivi per l’uomo. Qui di seguito abbiamo deciso di elencare i suoi principali argomenti e indicarne la fallacia. Per farlo, verranno citate alcune sue frasi e a seguito si potrà leggere il nostro commento in merito:

Perché sono favorevole alla ricerca animale e umana?
E’ già stato detto che c’è una differenza genetica, ma a me risulta che ci sia una identicità del 90% tra il topo e l’uomo. Non è del 100% ma non c’è mai una coincidenza genetica del 100%.

In realtà vi sono differenze epigenetiche significative addirittura tra noi e i primati non-umani (figuriamoci i topi!) che portano a una diversa suscettibilità a varie patologie [1].

Inoltre, nonostante abbiamo in comune il 98-99% del nostro DNA con lo scimpanzè (la specie geneticamente più vicina a noi), questa differenza dell’1-2% diventa un 80% di discordanza nel passaggio da geni a proteine. Questa comparazione è biologicamente significativa perché anche una singola sostituzione aminoacidica può avere effetti significativi sul fenotipo [2].

In aggiunta, vi sono differenze che rendono ben poco predittivo l’animale, sia proteiche che genetiche, nei seguenti campi [3]:
• la presenza (o assenza) di certi geni.
• la presenza (o assenza) di certi alleli.
• il background genetico e i geni modificatori che agiscono sui geni influenzati dai farmaci o dalla malattia.
• la regolazione e l’espressione dei geni. 
• le reti geniche.
• lo splicing alternativo, che permette a un gene di formare o di contribuire a formare molte proteine diverse.
• le proteine e le interazioni tra proteine.
• le interazioni tra geni e proteine.
• l’evoluzione di vecchi geni che li porta a svolgere nuove funzioni.
• il trasferimento genico orizzontale (TGO). Il TGO avviene quando i geni di un organismo vengono incorporati in un altro organismo senza che l’organismo ricevente discenda da quello donatore. Per esempio, la resistenza agli antibiotici può avvenire mediante TGO.
• le caratteristiche epigenetiche. Già accennata in precedenza, l’epigenetica è il settore relativamente nuovo che studia i cambiamenti dell’espressione genica che possono essere ereditati e che avvengono senza modifiche della sequenza di DNA coinvolta. Per esempio, a causa di influenze ambientali, un gene regolatore può essere modificato in modo tale da attivarsi o disattivarsi permettendo a una malattia di manifestarsi.
• la presenza di mutazioni geniche e cromosomiche come i polimorfismi del singolo nucleotide, le varianti del numero di copie, le duplicazioni, le inversioni, le delezioni e le inserzioni.
• la possibile perdita o acquisizione di determinati geni durante l’evoluzione.
• l’alterazione di geni o cromosomi.
• la diversità di geni per svolgere la stessa funzione.
• le differenze nelle reti di regolazione genica.
• le modificazioni post-traduzionali delle proteine.

Prima si è detto che condividiamo con altri mammiferi gli stessi tessuti, gli stessi organi, abbiamo fisiologie simili. E’ già stato detto che ci sono malattie che sono comuni fra umani e altre specie animali: il cancro, il diabete… affezioni del sistema immunitario e il sistema nervoso centrale e molte altre infezioni ivi incluso l’HIV. Lo condividiamo, tutto questo con gli animali.

In primis per quanto riguarda le malattie, invito a guardare qui sotto questa tabella, che illustra soltanto alcune note differenze tra gli esseri umani e le scimmie antropomorfe per quanto riguarda le più importanti condizioni mediche:
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Come si può notare vi sono accertate differenze per quanto riguarda quelle patologie che costituiscono importanti cause di morte o malattia nell’uomo: AIDS, epatite B e C, malaria, infarto del miocardio, influenza A. Non sono mai stati inoltre osservati nelle scimmie antropomorfe, sia in cattività che allo stato libero, condizioni patologiche comuni invece nella specie umana, quali ictus ischemici, morbo di Alzheimer, carcinomi, artrite reumatoide ed altre malattie autoimmuni, endometriosi, tossiemia gravidica, aborto spontaneo per aneuploidia fetale, asma bronchiale, psicosi maggiori [4].

Per quanto concerne le somiglianze, è vero, esistono, vi sono effettivamente processi conservati tra le specie, ma se possono essere utili nello studio dei processi biochimici di base, dove non vi è necessità di “scomodare” l’organismo intero nella sua complessità in quanto l’esame del processo conservato avviene allo stesso livello di organizzazione o nello stesso modulo ed è soggetto di studio del riduzionismo, l’uso del modello animale quale modello predittivo per l’uomo nello studio di patologie umane complesse, reazione a farmaci e vaccini, dispositivi, xenobiotici, ecc. implica spesso che il tratto o la risposta in fase di studio sia situato a livelli più alti di organizzazione, si trovi in un modulo diverso, o sia influenzato da altri moduli e dunque la mera presenza di processi conservati tra le specie diviene insufficiente per l’estrapolazione dei dati all’uomo. Infatti gli animali (uomo compreso) sono tipici esempi di sistemi complessi a molti livelli, dotati di proprietà emergenti, modulari e non lineari. Una perturbazione nel sistema S1 che provoca un effetto A, non necessariamente porterà allo stesso effetto A nel sistema complesso S2, a prescindere da quanto “simili” possano essere i sistemi S1 ed S2 [5].

Non è stato detto che il 90% della medicina veterinaria è uguale o molto simile alla medicina sviluppata per il trattamento degli umani. Perché il modello animale è quindi valido per la ricerca umana e animale? Sì sono dei modelli, e nessuno può attendersi che i modelli siano identici, non si può avere un modello identico agli umani né si può dire che il modello animale di una specie sia identico a quella di un’altra specie, ci sono delle differenze e queste differenze vanno prese in attenta considerazione.”

Questa obiezione è facilmente smontabile, se si conosce un minimo la situazione in veterinaria: la ricerca veterinaria è stata molto meno finanziata rispetto a quella umana. Infatti la maggioranza delle sostanze che sono state provate in veterinaria non sono nuove molecole ma principalmente quelle già usate nella medicina umana. Si tratta dunque di una correlazione spuria, dato che l’insieme delle medicine da cui si parte è già quello ad uso umano, pertanto anche una percentuale di fallimento altissima in altre specie non si noterebbe: se provi solo sostanze ad uso umano in altre specie, anche se dovessi scartare la maggioranza dei farmaci, tutti quelli che approverai rimarranno ad uso umano.
Inoltre questa percentuale non ci dice assolutamente se l’uso della molecola è lo stesso o se ad esempio va a curare malattie diverse da quelle che cura nell’uomo.
O ancora, non ci fa sapere se le dosi terapeutiche e/o tossiche coincidono tra uomo e animale.
Infine, in quante specie la molecola ad uso umano ha lo stesso risultato? Se una sostanza ha lo stesso effetto nell’uomo e ad esempio nel coniglio ma non lo ha in tutte le altre specie viene calcolata comunque in questa percentuale, e se la sostanza successiva avrà lo stesso effetto nell’uomo e nel cane ma non più nel coniglio nè in altre specie sarà ancora calcolata in questa percentuale!
Nel totale dunque può sembrare un grande numero, ma se si conta la concordanza tra ogni singola specie e l’uomo si avrà una cifra diversa e ci si renderà conto che i risultati si contraddicono tra una specie e l’altra.
Ad esempio uno studio veterinario del 2010 afferma:

The main conclusion from this review is that differences between species are numerous and often unpredictable in terms of both drug PK and drug PD. The ass is not a rustic horse; the horse is not a large rat; the sheep is not a small cow; “dog” does not exist as a single, simple entity and the concept of poultry or of non- salmonide fishes as simple entities are not applicable in veterinary pharmacology. No generalisations are possible. Rather, each drug must be investigated on a species- by-species basis to guarantee the effective and safe use of drugs, thus ensuring the wellbeing of animals and safeguarding also the environment and human consumption of animal products.” [6].

Inoltre Sietsema ha studiato 400 farmaci e confrontato la biodisponibilità orale negli esseri umani con tre altre specie, concludendo:

“Ciascuno dei grafici non è davvero niente di più di un diagramma di dispersione.” [7]

Una review del 2014 sulla biodisponibilità di 184 composti è arrivata alle stesse conclusioni:

“Linear regression for the reported compounds indicated no strong or predictive correlations to human data for all species, individually and combined. The lack of correlation in this extended dataset highlights that animal bioavailability is not quantitatively predictive of bioavailability in human. [8]

Però le somiglianze sono molto maggiori rispetto alla diversità. La diversità umana spiega anche perché all’interno della specie umana gli esseri umani hanno una risposta molto diversa alla stessa malattia o allo stesso vaccino o alla stessa medicina. Lo stesso succede anche tra animali fra l’altro, c’è una diversità all’interno del mondo animale

Come detto prima, anche una singola sostituzione aminoacidica può avere effetti significativi sul fenotipo, e le somiglianze tra specie perdono di valore quando si considera l’animale come un sistema complesso che ha interazioni tra le parti.
E’ vero, ma ci sembra banale spiegare che le differenze tra specie siano maggiori di quelle tra individui all’interno di una stessa specie.

In aggiunta, per capire se un metodo è predittivo bisogna avere degli standard con cui compararlo, trovare la percentuale di valore predittivo minimo che la società è disposta a tollerare. Tale percentuale è certamente quella che si richiede ai metodi alternativi per sostituire l’animale, inoltre si è già messo in luce nella letteratura scientifica che non esiste alcuna ragione giustificabile per sottoporre i test su animali a procedure nuove o considerevolmente modificate che siano meno rigorose di quelle applicate ai test e alle strategie di sperimentazione senza animali [9].
Gli attuali criteri di validazione dei metodi alternativi in ambito regolatorio sono, per la rilevanza:

“Screening tests: predictive value >0.50 (e.g., better than random classification)
Adjunct tests: predictive value >/=0.75
Replacement tests: predictive value >/=0.90.”

Mentre per la riproducibilità:

“Screening tests: c. 70
Adjunct tests: c. 70
Replacement tests: c. 80% (or better than the reproducibility of the particular animal test concerned).”
[10].

I modelli animali riescono ad arrivare a questi standard? Secondo i dati che abbiamo a disposizione, no. Come si può dunque pensare che un tale metodo possa essere considerato “predittivo” dalla società?

Ad esempio, secondo Hackam e Redelmeier la concordanza positiva dell’animale non supera il 33% [11], mentre secondo Greek [12], che riporta a sua volta i risultati di Heywood, il valore predittivo positivo sarebbe pari al 31% [13].
Per quanto riguarda invece la riproducibilità, un esempio ci può far capire attorno a quanto dovrebbe avvicinarsi la percentuale: Hartung [14] riporta i dati di Gottmann e colleghi, i quali, valutando il potenziale carcinogenico di 121 sostanze, hanno comparato i risultati provenienti dalla letteratura scientifica generale con quelli del National Cancer Institute/National Toxicology Program (NCI/NTP) e hanno rilevato solo il 57% di concordanza a parità di specie (topi e ratti) [15].
Ovviamente, essendo la riproducibilità all’interno della stessa specie così bassa, la trasposizione di questi risultati all’uomo non potrà di certo essere più alta.

Andiamo adesso ad analizzare, seguendo il ragionamento precedente, i criteri di validazione dei metodi alternativi, osservando quali sono i valori predittivi minimi e la percentuale di riproducibilità minima affinché un metodo venga validato come sostitutivo dell’animale.
Notiamo che i dati analizzati sopra non riescono spesso ad arrivare neanche al criterio minimo affinché un metodo venga accettato come test di screening. Ricordiamo che la percentuale che dovremmo aspettarci dall’animale, invece, dovrebbe essere almeno pari a quella pretesa dai metodi alternativi che lo sostituiscano completamente.

Quindi perché vi dico tutto questo partendo dal HIV… per dire che abbiamo bisogno di più modelli e dire che abbiamo comunque bisogno del modello animale anche se ha i suoi limiti.
Come hanno dei limiti tra l’altro anche i modelli alternativi. I modelli alternativi sono il vitro, il tessuto, le staminali e in silico, i modelli computerizzati, così detti. Vengono sviluppati dei nuovi modelli, vengono migliorati, affinati costantemente dagli scienziati e tra l’altro sono già ampiamente utilizzati questi modelli alternativi dalla scienza. Nel mio paese, in Francia, l’80% dei ricercatori che usano il modello animale avevano iniziato con i modelli alternativi, quindi solo quando non hanno avuto più scelta sono andati avanti col modello animale, per convalidare o meno dei dati che avevano ottenuto con metodi alternativi, che di per sé rischiano magari di non essere sufficienti
.”

Quelli di cui parla la signora NON sono i metodi alternativi di cui parliamo noi, ma solo ed esclusivamente i metodi approvati dall’ECVAM e inseriti nelle linee guida. Vi sono moltissime metodologie promettenti che non vengono considerate.

Perché? Il problema principale è il tempo di approvazione da parte dell’ECVAM, in secondo luogo il metodo di comparazione (i nuovi metodi alternativi vengono approvati a seguito della somiglianza dei risultati con l’animale e non con i dati che si conoscono sull’uomo), poi a seguire la mancata obbligatorietà dei metodi alternativi nella ricerca di base e applicata, i maggiori fondi alla ricerca su animali rispetto a quella human-based e la maggiore flessibilità dei comitati etici nell’approvazione di esperimenti su animali rispetto a quelli human-based [16].
Per maggiori informazioni sulle metodologie alternative a cui facciamo riferimento rimandiamo alla visione del nostro dossier (e del resto del sito).

Sappiamo che, i modelli alternativi, non possono rappresentare tutte le complesse interazioni fra tessuti ed organi che troviamo in un organismo completo, e quindi questo vuol dire che dovremo sviluppare migliori metodi alternativi in futuro e siamo tutti favorevoli a questo.”

E’ vero, gli animali sono sistemi complessi che hanno interazioni tra le parti – a differenza delle colture monocellulari (che tuttavia non sono le alternative che proponiamo) – ma le hanno tra parti talvolta simili e talvolta diverse. Il comportamento derivante dall’interazione tra parti è detto emergente e non può essere assimilato alla semplice somma tra le parti, pertanto la questione “interazioni” pone un serio problema in primis al modello animale, in quanto la somiglianza a questo punto perde di valore.

Infatti, considerato che spesso gli animali, in quanto sistemi diversamente complessi dall’Uomo, non sono adeguatamente predittivi, ad esempio perchè possono sussistere interazioni – oltre che con i moduli che stiamo analizzando e che presentano somiglianze – anche con il resto dell’organismo che differisce dall’Uomo, è preferibile partire dalle singole parti ricavate da materiale umano e successivamente ricreare nel modello le interazioni tra organi e tessuti che il nostro corpo avrebbe in natura.
Come riprodurre allora l’interazione? Esistono varie metodologie in proposito, le principali sono le seguenti:

– Co-colture 3D
– Organomica
– Microfluidica

Le co-colture sono colture di cellule diverse coltivate nello stesso recipiente, in modo da simulare un tessuto.
La tridimensionalità, rispetto alle classiche colture bidimensionali, aiuta queste colture cellulari a simulare un ambiente più simile a quello umano “in vivo” (vale a dire in un organismo vivente) [17], e metodologie sempre più avanzate come le IdMOC (Co-colture Integrate Discrete Multiorgano) [18] [19] ci permettono di arrivare a creare modelli di organi e interazioni tra essi.
L’organomica è lo sviluppo e lo studio di modelli di organo e sistemi di organo interconnessi in modo da comprendere meglio l’interazione tra tessuti e come questa interazione è usata per orchestrare la fisiologia sistemica.
Un esempio di metodo alternativo che sfrutta il principio dell’organomica è il sistema dei MCMB (bioreattori multicompartimentali modulari), che consente di coltivare più tipi di cellule in camere di coltura interconnesse in cui passa un flusso di sostanze nutritive che simula la circolazione sanguigna [20] [21] [22] [23].
La microfluidica è la scienza e tecnologia dei sistemi che processano o manipolano piccole quantità di liquidi utilizzando canali di dimensioni di decine o centinaia di micrometri.
Gli “Organs-on-Chips” sono (mini-)organi in 3D costituiti da tipi cellulari multipli e differenti che interagiscono tra loro sotto condizioni controllate, crescono in un chip microfluidico e mimano le complesse strutture e interazioni cellulari in e tra diversi organi e tipi di cellule [24] [25].

“Si era parlato di HIV, sono una esperta di HIV e so TUTTO quello che è stato fatto dal HIV ai modelli animali, dalla metà degli anni ottanta in poi. Ha ragione, i dati non sono stati di successo.
Qualcuno ha parlato di 100 vaccini, lasciamo perdere la cifra anche se alcuni hanno dimostrato una certa efficienza nel modello sui primati poi si sono dimostrati inefficaci sugli umani.”

No, non lasciamola perdere, si tratta di 85 vaccini efficaci sui primati risultati inefficaci in 197 successivi studi clinici sull’uomo che hanno coinvolto circa 20.000 volontari. Non so se si afferrano i numeri, ma li ripeto: 20.000 persone [26].

“Ma perché? E’ colpa del modello animale? O è colpa magari dello studioso o dello scienziato? Perché risulta che se guardiamo con attenzione la sperimentazione condotta per il vaccino del HIV all’inizio non si usava il modello giusto, non si usavano i valori giusti, la inoculazione giusta, e quindi si erano fatti tanti errori che non ci consentivano di parlare di un buon modello, adesso invece ci sono stati dei progressi notevolissimi e oggi vi posso dire che per esempio degli anticorpi ad ampio spettro che sono stati sviluppati hanno già provato di essere efficaci nei modelli animali nella riduzione della dimensione del serbatoio, cosiddetto, di HIV, il che fa si che il paziente possa farcela. E questo dato è stato recentemente confermato su umani! […] Il modello animale, di per sé, da solo non basta in effetti, non possiamo basarci solo su questo, dobbiamo andare avanti e passare su test clinici su umani che sono di un’importanza critica, per esempio per l’HIV, il mio campo. Sappiamo che ci sono alcuni, pochissimi, pazienti resistenti al HIV. Sappiamo che meno dello 0,3% della popolazione è resistente alla malattia. Ebbene, grazie a queste osservazioni sugli umani abbiamo sviluppato un modello animale completamente rappresentativo di quanto riscontrato sui pazienti.

In primis, i dati portati a sostegno di quest’ultima terapia sono trial clinici ancora non completati: molti altri vaccini sono arrivati alla fase dei trial clinici per poi fallire. Inoltre anche se fosse la volta buona, essa si dovrebbe sommare ai fallimenti, pertanto non potrebbe essere comunque definito “predittivo” il modello animale che avrebbe a seguito di così tanti insuccessi portato finalmente a un risultato utile. In secondo luogo, quali sarebbero i risultati tali da considerare il modello animale di HIV completamente rappresentativo? Non mi pare vi siano vaccini attualmente disponibili, i risultati dunque contraddicono questa esaltazione della SA. Si parla di zero risultati in decenni di studio, davvero vogliamo credere che sia tutto riducibile a errori umani? Per dimostrare che si tratta di differenze più profonde, riportiamo un paper del 2012:

“The failure to find a vaccine against HIV/AIDS has been attributed to numerous factors including the diversity and mutability of the virus and the lack of a good animal model. I readily acknowledge that HIV presents unique challenges and that these have been problematic for vaccine development. However, the search for, and reliance on, animal models is part of the problem and not a means to a solution.”

Tra le differenze interspecifiche, l’articolo elenca:

“[…] infection with HIV-1 does not progress to AIDS in chimpanzees [8,15,16] (or any other animal species except humans) [17-20]. Various differences between chimpanzees and humans have been offered in explanation of this. Chimpanzees have a higher body temperature [21-26]. HIV does not reproduce well in chimpanzees [27,28] and the chimpanzee immune system mounts little antibody-mediated or cell-mediated responses to HIV-l [28]. Chimpanzees do not develop any of the characteristic symptoms of AIDS, such as opportunistic infections or malignancies [29-31] and they develop only transient lymph node swelling in response to infection [29,30]. Moreover, chimpanzees do not experience degeneration in lymphoid follicles [21-26,32]. CD4+ to CD8+ lymphocyte ratios differ in humans and chimpanzees, CD4 decline is observed only in humans [27,28] and CD4+ T helper cells continue to regenerate in chimpanzees [21-26,32]. Chimpanzees do not manifest HIV infection of brain tissue or macrophages, and HIV has not been found in chimpanzee cerebral spinal fluid or saliva [19,33]. Their monocytes and macrophages also resist infection with HIV isolates [21-26,32]. […]. Infection with SIV progresses to AIDS in RMs infected with SIVsm but not in chimpanzees or sooty mangabeys (SM), or African green monkeys (AG) infected with SIVagm. Macaques infected with a hybrid of SIV and HIV (SHIV) progress to AIDS but the time to progression is significantly different from that observed in humans infected with HIV. The pathology revealed in SIV- or SHIV-infected monkeys does not duplicate human HIV. In addition, the replicative capacity and other parameters differ from HIV [37,38]. […] macaques exhibit a different neurological response to different strains SIV and SHIV of with no one model reproducing the human response. Different subspecies of macaques also demonstrate variability in their susceptibility to the central nervous system (CNS) effects of the viruses [45]. […]Over 1400 proteins that interact with HIV-1 in humans are recorded in the HIV-1 Human Protein Interaction Database [49]. Bozek and Lengauer [14] analyzed 1439 of these genes in humans, chimpanzees, rhesus macaques, and orangutans in order to discover genes and proteins under positive selection pressure. They determined that ~10% of the genes were under positive selection pressure. Many of these genes coded for proteins in the cell membrane or were involved in the innate immune response. These are significant findings especially in light of the interspecies differences in response to HIV. The results also forecast difficulty in inter-species extrapolation in terms of vaccine efficacy and safety.” [27].

Anche Bailey nota differenze significative:
“• AIDS — NHPs do not develop AIDS when infected with HIV. Despite this fact, NHPs continue to be used in HIV/AIDS research, often with the ‘related’ simian immunodeficiency virus (SIV), or an artificial hybrid of the two (SHIV). As with so many artificially-induced animal models of human diseases, the differences are too profound to allow any resulting data from them to be extrapolated to humans (Kaufman et al., 1996). For example:

– Infection progresses at a different rate in SIV/SHIV infected monkeys compared to HIV-infected humans.

– Some proteins from the coat of the virus have vaccine-like effects in monkeys, but not in people.

– Chimpanzees have an alteration in their DNA thatmakes their immune systems detect and respond to HIV and SIV viruses differently (Anzai et al., 2003).

– The lymph nodes of HIV-infected people undergo structural changes and contain deposits of the virus; neither occurs in chimpanzees (Koopman et al., 1999).

– Humans and chimpanzees have different ratios of crucial blood cells called T-lymphocytes.

– There are important differences in the cellular receptors involved in the infection process (Nath et al., 2000). [28].

Inoltre,  il gene per il recettore NKp44, (un recettore su un particolare tipo di cellule immunitarie) è 5 volte più espresso nello scimpanzé che nell’uomo. Tale recettore è coinvolto nel riconoscimento e nell’uccisione delle cellule tumorali o infettate da virus (tra cui HIV-1). Il fatto che negli scimpanzé l’infezione da HIV-1 abbia normalmente un decorso benigno potrebbe essere in parte spiegato da tale differenza nell’espressione genica [29].

E’ molto probabile che la variazione interspecifica dell’espressione di un singolo gene che codifica per una determinata proteina (inhibitory sialic acid-recognising Ig-superfamily lectins – Siglecs) abbia rilevanti conseguenze sulla risposta immunitaria verso molti patogeni, tra cui l’HIV. Ad esempio un articolo del 2010 sul Journal of Immunology evidenzia come alcuni dei geni che codificano per queste proteine siano meno espressi nell’uomo che nello scimpanzé. Sembra che ciò possa in parte spiegare le differenze tra uomo e scimpanzé nella risposta immunitaria verso HIV e virus dell’epatite C e predisponga l’uomo ad un’iperattività immunitaria, a sua volta legata a patologie autoimmuni (come artrite reumatoide e psoriasi) o all’asma [30].

Infine, se contiamo anche che sono passati 30 anni dalla scoperta e si sono investiti da 200 milioni di dollari nel 1985 a 21,7 miliardi nel 2006, l’ipotesi di un errore puramente umano appare semplicemente assurda [27].

EDIT:

Come c’era da immaginarsi, vi sono state da subito obiezioni al nostro articolo. Una in particolare, altamente diffamante, è la seguente:

“In un articolo che si propone di smentire gli argomenti del premio Nobel Barré-Sinoussi, viene mostrata una comparazione proteica che indica che le scimmie non rappresenterebbero un modello attendibile per l’uomo… e sapete da dove proviene tale comparazione? Si tratta di una citazione fuori contesto dai Creazionisti per dimostrare che l’uomo non avrebbe un progenitore in comune con le scimmie!”

In primis, noi non siamo assolutamente creazionisti, anzi, l’evoluzione è uno dei motivi principali per cui il modello animale è ben poco predittivo. Infatti essa ha permesso ai geni di svolgere nuove funzioni o di perderle nel corso del tempo.
Leggiamo, ad esempio, da Lynch (2009):
“[…] l’ipotesi che le funzioni geniche e i sistemi genetici siano conservati tra i modelli e gli esseri umani è data per scontata, spesso a dispetto di prove che le funzioni e le reti geniche divergono nel corso dell’evoluzione. In questa recensione, discuto alcuni meccanismi che generano divergenza funzionale e metto in evidenza esempi recenti che dimostrano che le funzioni geniche e le reti di regolazione divergono nel tempo. Questi esempi suggeriscono che l’annotazione di funzioni geniche basate esclusivamente su fenotipi mutanti nei modelli animali, così come le assunzioni di funzioni conservate tra le specie, possono essere sbagliate. Pertanto, i modelli animali di funzioni geniche e di malattie umane possono non fornire informazioni adeguate, in particolare per la rapida evoluzione di geni e sistemi. [31].

In secondo luogo si è affermato che lo studio portato a sostegno della differenza dell’80% a livello proteico tra uomo e scimpanzè rivelerebbe una differenza molto minore, perchè anche se le proteine differiscono a livello di sequenze aminoacidiche, quest’80% di proteine differirebbe solo di poco. In primis c’è però da dire che anche una singola sostituzione aminoacidica può avere effetti significativi a livello fenotipico, leggiamo infatti dall’articolo citato (Glazko et al., 2005):
“Our comparison of human and chimp proteins showed that the 80% of proteins are different between humans and chimps. This comparison is biologically meaningful because even one amino acid substitution may have significant effects on phenotypic differences. [2].

Inoltre vi sono certamente meccanismi condivisi che però non sono isolati, bensì inseriti in un contesto complesso. La diversità delle proteine è solo un aspetto della complessità: esistono infatti interazioni tra proteine diverse e/o con altre molecole, esiste la diversità nella regolazione e nell’espressione genica. Le pathways ad esempio possono conservate ma magari è diversa la regolazione e l’interazione con altre vie. Le proteine possono anche non essere strutturalmente diverse ma può variare la loro quantità. In aggiunta, anche una minima variazione nella sequenza può comportare grandi variazioni nella conformazione, nella funzione e soprattutto nella regolazione e nell’interazione con le altre. Un banale esempio dell’importanza della regolazione lo troviamo su un recentissimo articolo apparso sulla rivista Altex, di cui riportiamo una figura ed una didascalia piuttosto eloquenti:

altexglucose [32]

Vi sono perciò dei motivi più che fondati per ritenere appropriata la citazione dell’articolo di Glazko sulle differenze proteiche tra uomo e scimpanzé nell’ambito della critica scientifica a taluni modelli animali.

Riferimenti bibliografici:

1. [Zeng J, Konopka G, Hunt BG, Preuss TM, Geschwind D, Yi SV. Divergent whole-genome methylation maps of human and chimpanzee brains reveal epigenetic basis of human regulatory evolution. Am J Hum Genet. 2012 Sep 7;91(3):455-65.]

2. [Glazko G, Veeramachaneni V, Nei M, Makałowski W. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene. 2005 Feb 14;346:215-9.]

3. [Greek R, Pippus A, Hansen LA. The Nuremberg Code subverts human health and safety by requiring animal modeling. BMC Med Ethics. 2012 Jul 8;13:16.]

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In difesa di Aysha Akhtar: non restiamo ancorati alla sperimentazione animale!

Il gruppo statunitense pro-SA “Speaking of Research” (SoR) ha attaccato – nei suoi articoli “Why animal research is done humanely — Reason 1: Stressed Animals Yield Poor Data” e “Why Animal Experiments Work – Reason 2: Animals Can Mimic Human Diseases” – l’intervento sull’Huffington Post della dottoressa Aysha Akhtar, nota neurologa e critica della SA, la quale aveva criticato aspramente i modelli animali per diverse ragioni.
La risposta di SoR è divisa in due parti, nella prima si dà parzialmente ragione alla dottoressa, la quale sosteneva che le condizioni in cui gli animali erano stipati alterassero i risultati degli esperimenti a causa dello stress. In questa prima parte si è affermato tuttavia che, grazie a gabbie più grandi, i risultati sarebbero stati predittivi.
Quest’affermazione è però contraddetta da dati che dimostrano che anche le più comuni pratiche di laboratorio, come manipolazione (ad esempio pulizia delle gabbie, spostamento delle stesse, spostamento degli animali, ecc.), prelievo ematico e introduzione di sonde oro-gastriche facciano aumentare i parametri collegati allo stress. “Le alterazioni variano tra il 20% ed il 100% ed oltre in più rispetto ai valori basali o ai controlli. Tali alterazioni hanno una durata minima di 30 minuti dalla fine della pratica. I risultati dello studio suggeriscono che le pratiche abituali di laboratorio causino notevole stress negli animali e che gli animali non siano in grado di adattarsi alle stesse in tempi brevi: questi fenomeni hanno implicazioni etiche e scientifiche per quanto riguarda l’uso degli animali nella ricerca.” [1].

Per quanto riguarda invece la seconda parte, la dottoressa Akhtar fa notare come vi siano differenze impressionanti tra cellule pancreatiche umane e animali [2].
In risposta, gli autori di SoR citano un’intervista (quindi materiale NON peer-reviewed e privo di dati) di uno di questi autori, secondo cui questo risultato non inficerebbe il valore dei modelli animali in sé, ma piuttosto sottolineerebbe “l’importanza fondamentale della ricerca traslazionale, cioè, determinare se le osservazioni ottenute in studi su roditori siano rilevanti per i pazienti. Usando tessuti umani e sistemi modello pre-clinici, siamo in grado di trasferire qualsiasi nuova scoperta pertinente verso nuovi trattamenti per i pazienti nel modo più veloce, sicuro ed efficiente possibile”. Dati a sostegno di quest’affermazione? ZERO.
Insomma si tratta di una semplice frase priva di prove e rappresentante esclusivamente un proprio pensiero personale non verificabile né tantomeno verificato. Semmai fa notare come, anche in presenza di dati contrastanti, il pregiudizio di predittività del modello animale resti ancorato.

Gli autori passano ad esaminare i farmaci sull’ictus. Affermano che, nonostante molti farmaci per trattare l’ictus siano risultati fallimentari, uno dei più importanti attualmente in uso inizialmente sarebbe passato attraverso la sperimentazione su conigli. Questo, d’altra parte, non ci dice nulla, dato che per valutare l’efficacia di una tecnica (in questo caso la SA) dobbiamo conoscerne sia i fallimenti che i successi: anche un importante successo, se rimane isolato, non dimostra assolutamente che un metodo sia predittivo, ma solo che si ha avuto fortuna (o molte risorse da spendere!). Un metodo è predittivo se ci dà un’alta sensibilità (Veri Positivi sul totale di Veri Positivi + Falsi Negativi), un’alta specificità (Veri Negativi sul totale di Falsi Positivi + Veri Negativi), un alto valore predittivo positivo (Veri Positivi sul totale di Veri Positivi + Falsi Positivi) e un alto valore predittivo negativo (Veri Negativi sul totale di Falsi Negativi + Veri Negativi). Il resto è pura e semplice aneddotica.

Successivamente gli autori di SoR citano “Can animal models of disease reliably inform human studies?”, un articolo che – a loro detta – affermerebbe che, migliorando la qualità degli esperimenti su animali, questi ultimi diventerebbero buoni modelli per l’ictus.
In realtà l’articolo cita sì come migliorare i modelli animali, ma non nega che restino problemi anche in esperimenti di alta qualità, infatti afferma:
“In fact, clinical trials are essential because animal studies do not predict with sufficient certainty what will happen in humans. In a review of animal studies published in seven leading scientific journals of high impact, about one-third of the studies translated at the level of human randomised trials, and one-tenth of the interventions, were subsequently approved for use in patients. However, these were studies of high impact (median citation count, 889), and less frequently cited animal research probably has a lower likelihood of translation to the clinic. Depending on one’s perspective, this attrition rate of 90% may be viewed as either a failure or as a success, but it serves to illustrate the magnitude of the difficulties in translation that beset even findings of high impact.[3].

Successivamente citano altri due articoli di Macleod, ma il primo è una review interna alla sperimentazione animale stessa (ovvero su quanti esperimenti il trattamento in esame ha funzionato), ergo non ci dice nulla sulla predittività del modello animale, e neanche il secondo ci dà dati. Vengono postati solo ed esclusivamente per far notare che anche i critici della SA usano il modello animale. Certo, uno utilizza ciò che ha, ma questo non significa che il modello animale sia predittivo o che la persona abbia provato che sia predittivo, significa che si utilizza l’unico strumento che si conosce e si spera che funzioni, ma lo stesso autore, come dimostrato poco fa, è consapevole che anche con esperimenti di alta qualità la traslabilità dei dati dall’animale sarà comunque molto difficile.

Infine, la dottoressa Akhtar viene accusata di cherry picking per aver citato le parole di Susan Fitzpatrick, che affermava sul NewScientist:
“Even if we know all there is to know about the animal model we don’t necessarily know about the disease”.

Gli autori di SoR citano nell’articolo persone che propongono come soluzione nuovi modelli animali. Il problema è che queste sono proposte, non prove di predittività: l’unica cosa certa che sappiamo è che i modelli usati fino a quel momento sono stati fallimentari, vale a dire la parte presa in esame proprio dalla dottoressa, pertanto l’accusa di cherry picking è infondata. Inoltre, come sopra dimostrato, pur migliorando la qualità degli esperimenti su animali, non si riesce comunque a ottenere un risultato altamente predittivo, ergo perché sprecare soldi e tempo a migliorare un modello fallimentare e limitato piuttosto che impiegarli per andare oltre?

Come ha affermato infatti il British Medical Journal nel 2014:
“Cosa fare a questo proposito? Condurre e riportare meglio la ricerca su animali aiuterà, dicono Pound e Bracken. […] Ma quanto questo potrebbe davvero migliorare il tasso di traslazione di successo dagli animali agli esseri umani? Non molto, a quanto pare. Anche se la ricerca fosse condotta in maniera impeccabile, sostengono gli autori, la nostra capacità di prevedere le risposte umane partendo da modelli animali sarà limitata da differenze interspecifiche nelle vie molecolari e metaboliche. […] Gli autori concludono: “Se la ricerca condotta sugli animali continua a non essere in grado di prevedere ragionevolmente quello che ci si può aspettare negli esseri umani, la continua approvazione pubblica e il finanziamento alla ricerca preclinica su animali sembrano fuori luogo”.” [4]

Note:
[1] Balcombe J, Barnard N, Sandusky C. Laboratory routines cause animal stress. Contemp Top Lab Anim Sci 2004; 43(6): 42-51.
[2] Cabrera O, Berman DM, Kenyon NS, Ricordi C, Berggren PO, Caicedo A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Feb 14;103(7):2334-9.
[3] van der Worp HB, Howells DW, Sena ES, Porritt MJ, Rewell S, O’Collins V, et al. (2010) Can Animal Models of Disease Reliably Inform Human Studies? PLoS Med 7(3): e1000245.
[4] Fiona Godlee. How predictive and productive is animal research? BMJ 2014;348:g3719.