Caratteri conservativi e modelli animali

Modelli animali e processi conservati

Gli animali (uomo compreso) sono tipici esempi di sistemi complessi a molti livelli, dotati di proprietà emergenti, modulari e non lineari. Una perturbazione nel sistema S1 che provoca un effetto A, non necessariamente porterà allo stesso effetto A nel sistema complesso S2, a prescindere da quanto “simili” possano essere i sistemi S1 ed S2.
Mentre nello studio dei processi biochimici di base non c’è bisogno di “scomodare” l’organismo intero nella sua complessità in quanto l’esame del processo conservato avviene allo stesso livello di organizzazione o nello stesso modulo ed è soggetto di studio del riduzionismo, l’uso del modello animale quale modello causale analogo (CAM) ovvero come modello predittivo per l’uomo nello studio di patologie umane complesse, reazione a farmaci e vaccini, dispositivi, xenobiotici, ecc. implica spesso che il tratto o la risposta in fase di studio sia situato a livelli più alti di organizzazione, si trovi in un modulo diverso, o sia influenzato da altri moduli e dunque la mera presenza di processi conservati tra le specie diviene insufficiente per l’estrapolazione dei dati all’uomo.
Questo concetto viene espresso magnificamente dalla pubblicazione di Greek e Rice che ci apprestiamo a riportare:

[Greek R, Rice MJ. Animal models and conserved processes. Theor Biol Med Model. 2012 Sep 10;9:40. doi: 10.1186/1742-4682-9-40.]

Abstract:

Background
Il concetto di processi conservati presenta opportunità uniche per l’uso di modelli animali non-umani nella ricerca biomedica. Tuttavia, il concetto deve essere esaminato nel contesto che gli animali umani e non-umani sono sistemi evoluti, complessi e adattivi. Dato che gli animali non-umani sono esempi di sistemi viventi che sono differentemente complessi dagli umani, cosa implica l’esistenza di un gene o di un processo conservato per l’estrapolazione inter-specie?

Metodi
Abbiamo esaminato la letteratura includendo riviste di filosofia della scienza, complessità biologica, caratteri conservativi, biologia evolutiva, medicina comparata, agenti antineoplastici, anestetici inalatori e sviluppo dei farmaci, al fine di determinare il valore di modelli animali non-umani quando lo vengono studiati i processi conservati.

Risultati
L’evoluzione, attraverso la selezione naturale, ha impiegato componenti e processi, sia per produrre gli stessi risultati tra le specie, ma anche per generare diverse funzioni e caratteristiche. Molti geni e processi sono conservati, ma nuove combinazioni di questi processi o diverse regolazioni dei geni coinvolti in questi processi hanno prodotto organismi unici. Inoltre, vi è una gerarchia di organizzazione nei sistemi complessi viventi. In alcuni livelli, i componenti sono sistemi semplici che possono essere analizzati dalla matematica o le scienze fisiche, mentre in altri livelli il sistema non può essere completamente analizzato riducendolo a un sistema fisico. Lo studio dei sistemi complessi viventi deve alternare la concentrazione sulle parti e l’esaminazione dell’intero organismo intatto mentre si tiene conto delle connessioni tra i due. La biologia dei sistemi propone questo olismo. Abbiamo esaminato le azioni degli agenti anestetici inalatori e degli agenti anti-neoplastici al fine di affrontare cosa implicano le caratteristiche dei sistemi viventi complessi per l’estrapolazione inter-specie dei tratti e delle risposte relative ai processi conservati.

Conclusione
Concludiamo che anche la presenza di processi conservati è insufficiente per l’estrapolazione inter-specie quando il tratto o la risposta in fase di studio è situata a livelli più alti di organizzazione, è in un modulo diverso, o è influenzata da altri moduli. Tuttavia, quando l’esame del processo conservato avviene allo stesso livello di organizzazione o nello stesso modulo, e quindi è soggetto a di studio unicamente del riduzionismo, allora l’estrapolazione è possibile.

Full Text: http://www.tbiomed.com/content/9/1/40

Ricerca di base e 0,004%

Recentemente il dottor Robin Lovell-Badge ha scritto un articolo, “How to distort 0,004% of the statistics” (“Come distorcere lo 0,004% delle statistiche”), pubblicato anche sul blog di Speaking of Research.
Lovell-Badge inizia la sua spiegazione partendo dall’affermazione che “solo lo 0,004 per cento di tutta la sperimentazione animale è di diretto beneficio alla salute umana”. Lo 0,004% proviene da Crowley [1], ma queste non sono le esatte parole.
Contopoulos-Ioannidis et al hanno esaminato sei delle principali riviste scientifiche per valutare il tempo impiegato e la quantità di studi di ricerca di base molto promettenti traslati nella sperimentazione e nell’uso clinico. Hanno pubblicato i loro risultati nell’articolo “Translation of highly promising basic science research into clinical applications” del The American Journal of Medicine [2]. Su 101 articoli di ricerca di base pubblicati nelle riviste tra il 1979 e il 1983, 27 hanno portato a studi clinici randomizzati e 5 alla fine hanno dato origine ad un’applicazione clinica brevettata. Un tasso di traslazione del ~ 27% non è male.

Ma ci sono state alcune critiche dell’articolo. Crowley ha commentato l’articolo:

“L’articolo di Contopoulos-Ioannidis et al. [2003] in questo numero della rivista tratta una questione molto discussa ma raramente quantificata: la frequenza con cui i risultati della ricerca di base si traducono in utilità clinica. Gli autori eseguirono una ricerca algoritmica al computer di tutti gli articoli pubblicati in sei delle principali riviste scientifiche (Nature, Cell, Science, Journal of Biological Chemistry, Journal of Clinical Investigation, Journal Experimental Medicine) dal 1979 al 1983. Dei 25.000 articoli ricercati, circa 500 (2%) contenevano qualche pretesa di potenziale applicazione agli umani, circa 100 (0,4%) hanno portato a una prova clinica e, secondo gli autori, solo 1 (0,004%) ha condotto allo sviluppo di una classe di farmaci clinicamente utili (gli inibitori dell’enzima convertitore dell’angiotensina) nei 30 anni successivi alla pubblicazione del risultato scientifico di base.
Essi hanno anche trovato che la presenza di supporto industriale aumentava la verosimiglianza di tradurre un risultato di base in una prova clinica di 8 volte. Tuttavia, indipendentemente dalle limitazioni dello studio, e anche se gli autori avessero sottostimato di un fattore 10 la frequenza di traduzioni con successo in prove cliniche, i loro risultati suggeriscono fortemente che, come la maggior parte degli osservatori sospettavano, il tasso di trasferimento della ricerca di base all’utilizzo clinico è molto basso.” [1]

La maggior parte delle persone troverebbero davvero una grande differenza tra le cifre “27%” e “0,004%”. Lovell-Badge quindi tenta di spiegare la differenza.

La critica principale di Lovell-Badge sembra essere il fatto che Contopoulos-Ioannidis et al abbiano utilizzato dei filtri per eliminare la ricerca che sembrava non avere alcuna pretesa di rilevanza clinica. Il numero totale dei documenti valutati da Contopoulos-Ioannidis et al era 25.190. Li hanno poi filtrati attraverso le parole: ‘therapy’, ‘therapies’, ‘therapeutic’, ‘therapeutical’, ‘prevention’, ‘preventative’, ‘vaccine’, ‘vaccines’, o ‘clinical’ (terapia, terapie, terapia, terapeutico, prevenzione, preventivo, vaccino, vaccini, o clinico). Se una qualsiasi di queste parole era inclusa nell’articolo, gli autori li investigavano maggiormente, ma se queste parole non erano nell’articolo gli autori hanno presunto che i paper non stavano annunciando alcun intervento clinicamente rilevante che potesse derivare dalla loro ricerca. Questo è un presupposto molto ragionevole. Certo, gli autori possono aver perso un occasionale paper che avrebbe cambiato le cure mediche, ma dato che i ricercatori biomedici hanno la tendenza ad esagerare l’importanza delle loro ricerche, l’assenza di uno di questi termini sembra ragionevole in termini di compiere ulteriori decisioni. E’ difficile immaginare un paper che dia eventualmente origine a un nuovo sviluppo di cure mediche a cui manchi almeno una di queste parole da qualche parte in tutto l’articolo. Non riesco a immaginare un qualunque paper degno di nota che manchi di queste parole nell’abstract. O nel titolo! Infine, l’utilizzo di tali filtri è uno standard accettato in questo tipo di ricerche. Quindi, se Lovell-Badge vuole mettere in discussione la pratica, dovrà scontrarsi contro un numero estremamente elevato di buoni studi.

Inoltre, Lovell-Badge sembra equiparare “un nuovo farmaco” con “una nuova classe di farmaci clinicamente utili”. Nuovi farmaci sono sempre sviluppati, ma una nuova classe di farmaci è rara e di solito presuppone un “cambio del gioco”. Crowley non sosteneva che nuovi farmaci non sono stati sviluppati, ma piuttosto che solo una nuova classe era stata scoperta a causa di un paper. Questa è una grande differenza e impatta sulle critiche di Lovell-Badge. Inoltre anche contando i singoli farmaci sviluppati, che nello studio sono 5, il dato dei fallimenti non si discosta quasi per nulla.

Altre critiche sono banali. Ad esempio, Lovell-Badge inizia il saggio criticando l’arbitrario intervallo di 20 anni tra la pubblicazione e la valutazione da parte di Contopoulos-Ioannidis et al. (Gli studi analizzati sono stati pubblicati tra il 1979 e il 1983 e il documento è stato pubblicato nel 1983, permettendo così di dare almeno 20 anni per un risultato clinicamente significativo del paper originale.) C’è qualcosa di vero per il fatto che più un paper è disponibile, più possibilità ci saranno per sviluppare un’applicazione clinicamente utile, ma nella vita reale le valutazioni devono essere fatte in termini di “se il tipo di ricerca merita che gli vengano assegnati soldi”, e simili studi hanno anch’essi messo in dubbio il tasso di rendimento della ricerca di base. [3-6] Il periodo di 20 anni è adeguato per questi scopi, ma ovviamente non è onnicomprensivo. Se fosse onnicomprensivo, ci sarebbero altri problemi, come vedremo.

Sulla stessa linea, Lovell-Badge afferma che c’erano alcuni paper di importanza clinica che Contopoulos-Ioannidis et al perse e quindi la percentuale sarebbe stata più alta se fossero stati inclusi. Io non sono certo che i paper a cui si sta riferendo abbiano portato a nuove classi di farmaci e se in questo caso poi Crowley e la carta originale sarebbero stati comunque corretti. Ma a prescindere, 1) stiamo parlando di cifre diverse dopo la virgola, non si sta alzando la cifra dallo 0,004% al 4% o al 40%. Qualsiasi analisi sarà imperfetta, in qualche modo, il che è probabilmente il motivo per Crowley afferma nel suo saggio: “anche se gli autori avessero sottostimato di un fattore 10 la frequenza di traduzioni con successo in prove cliniche, i loro risultati suggeriscono fortemente che, come la maggior parte degli osservatori sospettavano, il tasso di trasferimento della ricerca di base all’utilizzo clinico è molto basso.”[1]

2) Inoltre, tale analisi fatta con il senno di poi va in entrambe le direzioni. Quanti paper hanno portato a interventi clinici che hanno danneggiato le persone e quanti di questi sono stati scoperti solo dopo le pubblicazioni di Contopoulos-Ioannidis et e di Crowley? Gli scienziati non sono ansiosi di sottolineare la ricerca scientifica di base che ha portato a danneggiamenti, come i meccanismi di ingresso del poliovirus, le prime ricerche sugli animali basate sull’HIV compreso il meccanismo di entrata del virus HIV, e la miriade di farmaci che sono stati cancellati dopo aver danneggiare gli esseri umani negli studi clinici. I meccanismi di questi farmaci erano stati suggeriti dalla ricerca di base su animali e, quindi, avevano proceduto allo sviluppo. Se questi fattori avessero tenuto conto del rapporto danni-benefici, il rapporto della ricerca di base su an
imali sarebbe stato probabilmente molto maggiore di 1-0. Questo è uno studio che dovrebbe essere finanziato!

Lovell-Badge continua criticando l’analisi Crowley sulla base di dati che non erano disponibili al momento e di altri fattori che, anche se fossero corretti, non avrebbero influenzato notevolmente la cifra dello 0,004%. Non importa come lo si gira, la percentuale finale sta intorno alla zona dello 0.004%, non nella zona del 27%. Questo ci porta anche indietro al fatto che lo studio ha esaminato solo i successi al contrario dei danni, qualcosa che Lovell-Badge ignora. Se si desidera esaminare onestamente uno studio o una pratica bisogna assicurarsi che la propria analisi consideri sia i risultati positivi che negativi e quindi non sia un esempio di cherry picking.

Lovell-Badge afferma che la ricerca di base può essere divisa in ricerca che utilizza gli animali e ricerca che non li utilizza. Sono d’accordo. Tuttavia, egli afferma poi che non siamo in grado di trarre conclusioni circa la sperimentazione animale in quanto tale ricerca non è stata separata dalla ricerca di base incentrata sull’uomo. Questo è matematicamente falso. Siamo in grado di trarre le seguenti conclusioni.

1. La ricerca di base, in generale, ha un tasso di successo molto basso in termini di traslazione di farmaci e interventi che beneficino gli esseri umani.

2. Possiamo trarre conclusioni basate su di un successo. Lo sviluppo degli inibitori dell’enzima convertitore dell’angiotensina, l’unico successo di 25.000, è basato su metodologie non-animali e tessuti provenienti da animali. Ma i tessuti potrebbero essere stati raccolti dagli esseri umani. Ancora una volta vediamo una svolta che ha usato tessuti animali, ma che avrebbe avrebbe potuto utilizzare tessuti umani. Questo non è un esempio della necessità dell’utilizzo di animali per le scoperte! Se si difende una pratica eticamente controversa si deve concedere che, quando altri metodi potrebbero portare ad una svolta, l’uso eticamente controverso è più difficile da giustificare.

3. Alcuni dei 25.000 e più articoli di ricerca di base esaminati da Contopoulos-Ioannidis et al erano probabilmente incentrati sull’uomo, il che significa che sono stati studiati esseri umani o tessuti umani. Data la nostra attuale comprensione dell’evoluzione e dei sistemi complessi ne consegue che se la ricerca che utilizza tessuti umani ha un basso tasso di rendimento, la ricerca che studia una specie diversa produrrà un tasso ancora più basso di rendimento. La letteratura sullo sviluppo di farmaci è la migliore che abbiamo per giudicare la ricerca sugli animali e chiaramente i modelli animali non sono ottimali per predire la risposta umana a farmaci.

Infine, sperando di far tacere definitivamente la nozione che il paper di Crowley fosse fatalmente difettoso, possiamo aggiungere che l’articolo è peer-reviewed e ha superato gli standard del “The American Journal of Medicine: Official Journal of the Alliance for Academic Internal Medicine”. Considerata la posizione del The American Journal of Medicine, è improbabile che un articolo che era fatalmente distorto come Lovell-Badge pretende che fosse l’articolo di Crowley, sarebbe stato pubblicato. Né l’autore nè la rivista hanno ritirato il paper, né vi è stata alcuna seria critica del paper. Inoltre, i problemi di cui parla Lovell-Badge non appaiono in nessuna delle recensioni o dei commenti editoriali riguardanti il paper di Crowley. Anche Nature Medicine non ha messo in discussione le conclusioni di Crowley. Uno dei coautori del paper di Contopoulos-Ioannidis, JP Ioannidis, ha dichiarato: “Vi è una considerabile evidenza che il tasso di traslazione delle maggiori promesse della scienza di base per l’applicazione clinica sia stato inefficente e deludente.” [7] Egli ha ribadito questo in altre pubblicazioni e di non è solo nel suo pensiero. Molti hanno reiterato questo concetto (vedi “Is the use of sentient animals in basic research justifiable?”). Alla luce della natura banale e fuorviante dei commenti di Lovell-Badge, la fama di The American Journal of Medicine non è in alcun modo in pericolo.

Riferimenti:

1. Crowley WF, Jr.: Translation of basic research into useful treatments: how often does it occur? Am J Med 2003, 114(6):503-505.

2. Contopoulos-Ioannidis DG, Ntzani E, Ioannidis JP: Translation of highly promising basic science research into clinical applications. Am J Med 2003, 114(6):477-484.

3. Grant J, Cottrell R, Cluzeau F, Fawcett G: Evaluating “payback” on biomedical research from papers cited in clinical guidelines: applied bibliometric study. BMJ 2000, 320(7242):1107-1111.

4. Grant J, Green L, Mason B: From Bedside to Bench: Comroe and Dripps Revisited. In: HERG Research Report No 30 Health Economics Research Group. Brunel University, Uxbridge, Middlesex UB8 3PH, UK; 2003.

5. Grant J, Green L, Mason B: Basic research and health: a reassessment of the scientific basis for the support of biomedical science. Research Evaluation 2003, 12(3):217-224.

6. Grant J, Hanney S, Buxton M: Academic medicine: time for reinvention: research needs researching. BMJ 2004, 328(7430):48; discussion 49.

7. Ioannidis JP: Materializing research promises: opportunities, priorities and conflicts in translational medicine. J Transl Med 2004, 2(1):5.

[Preso ed adattato da: “0.004 Percent” by Ray Greek published on “Opposing Views” – http://www.opposingviews.com/i/society/animal-rights/0004-percent]

Modelli animali e danni al miocardio

Si parla di danno da riperfusione ad un tessuto quando la circolazione sanguigna torna al tessuto dopo un periodo di ischemia. L’assenza di ossigeno e nutrienti crea una condizione in cui il ripristino della circolazione ha come risultato l’infiammazione e lo stress ossidativo con conseguente danno ai tessuti coinvolti, invece della ripresa della normale funzionalità.
Diversi meccanismi sono coinvolti in questo fenomeno:
° Perdita dell’omeostasi ionica
° Attivazione dell’enzima xantina ossidasi
° Produzione di nitroperossido
° Disfunzioni mitocondriali
° Richiamo di cellule infiammatorie
° Eccitotossicità

La terapia principale utilizzata nei pazienti colpiti da infarto del miocardio per limitare le dimensioni dell’infarto stesso è basata sulla riperfusione miocardica meccanica o farmacologica.

Tuttavia, la riperfusione è stata associata ad ulteriori danni del miocardio successivi a quelli causati dall’ischemia precedente, questo processo viene definito per l’appunto ”danno da riperfusione”, in inglese ”reperfusion injury” (RI).

Mentre il meccanismo preciso dell’RI non è stato ancora del tutto compreso, una gran numero di studi clinici sono stati eseguiti negli ultimi 10 anni volti a comprendere i postulati del meccanismo del danno da riperfusione.

Questi studi clinici si sono basati su dati sperimentali ottenuti su modelli animali negli studi preclinici che mostravano significativi benefici del trattamento miocardico.

Ciò nonostante, i benefici clinici su pazienti umani, contrariamente ai risultati positivi ottenuti in fase preclinica su animali, sono stati molto limitati o addirittura del tutto assenti.

Vi sono numerose differenze tra i risultati derivanti dai modelli animali utilizzati negli studi sperimentali ed i risultati riscontrati nelle fasi cliniche, tra cui il fatto che gli studi sperimentali preclinici in genere utilizzano una brusca occlusione e protocolli di riperfusione negli animali con un miocardio precedentemente all’intervento in condizioni sane, che, a quanto pare, non risulta predittivo dell’efficacia terapeutica di nuovi agenti cardioprotettivi in ambito clinico con pre-esistente malattia progressiva coronarica, occlusione coronarica intermittente, ed una tardiva riperfusione. Inoltre, esistono differenze di risultato anche tra gli studi sperimentali stessi.

[Dirksen MT, Laarman GJ, Simoons ML, Duncker DJ. Reperfusion injury in humans: a review of clinical trials on reperfusion injury inhibitory strategies. Cardiovasc Res. 2007 Jun 1;74(3):343-55. Epub 2007 Jan 23. – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17306241%5D

Negli ultimi 30 anni, sono stati segnalati centinaia di interventi sperimentali (farmacologici e non) per proteggere con successo il miocardio ischemico negli animali da esperimento, tuttavia, con l’eccezione della riperfusione precoce, nessuno si è tradotto in pratica clinica.
Per tre decenni, notevoli risorse sono state investite in studi singoli che hanno spesso dato risultati inconcludenti.

[Bolli R, Becker L, Gross G, Mentzer R Jr, Balshaw D, Lathrop DA; NHLBI Working Group on the Translation of Therapies for Protecting the Heart from Ischemia. Myocardial protection at a crossroads: the need for translation into clinical therapy. Circ Res. 2004 Jul 23;95(2):125-34. – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15271864%5D

[A.L.]

Malattia indotta vs malattia spontanea: fallimento del modello animale nell’osteoartrite

”L’osteoartrite (OA), la più comune di tutte le artropatie, è una delle principali cause di disabilità e ha un grande (e crescente) costo socio-economico in tutto il mondo. Nonostante la sua importanza crescente, le traslazioni di terapie modificanti la malattia OA, dal laboratorio alla pratica clinica, hanno subito un rallentamento. Le differenze tra i modelli preclinici di OA studiati e la malattia valutata negli studi clinici umani hanno contribuito a questo fallimento. Alla maggior parte dei modelli animali di OA viene indotta la malattia attraverso interventi chirurgici o interruzione meccanica di biomeccanica articolare nei giovani individui, piuttosto che riscontrare lo sviluppo spontaneo della malattia associata all’età. 
Questa malattia instabilmente indotta, comune nei migliori modelli animali dell’artrite che si sviluppa naturalmente negli esseri umani dopo un evento dannoso, è nota come OA post-traumatica (PTOA). Studi nei topi geneticamente modificati suggeriscono che la PTOA dispone di una fisiopatologia molecolare distinta rispetto a quella di OA spontanea, il che potrebbe spiegare la cattiva traslazione dal preclinico ai trial clinici terapeutici di OA.”

Gli autori del paper di cui abbiamo riportato il grosso dell’abstract, elencano nel loro studio i più recenti dati ottenuti su topi geneticamente modificati in riferimento alla validazione per quanto concerne gli studi preclinici terapeutici.
Gli stessi autori, in quanto ricercatori che studiano i modelli animali dell’OA, presentano le difficoltà oggettive della traslazione di dati dalle fasi precliniche sperimentali a quelle cliniche su esseri umani, suggerendo, a loro parere, l’ennesima proposta di come potrebbe essere possibile tradurre gli studi dall’animale all’uomo.
Anni ed anni ed anni di risorse impiegate, di proposte suggerite, di dati inconcludenti e risultati a dir poco scoraggianti..

” Le differenze tra i modelli preclinici di OA studiati e la malattia valutata negli studi clinici umani hanno contribuito a questo fallimento.”

Fonte:

[Little CB, Hunter DJ, Post-traumatic osteoarthritis: from mouse models to clinical trials, Nat Rev Rheumatol. 2013 May 21. doi: 10.1038/nrrheum.2013.72 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23689231]

[A.L.]

Dalla biopsia della pelle alla creazione di neuroni grazie alle cellule staminali

Uno studio del 2011 mostra come sia possibile ottenere neuroni e cellule della glia partendo da cellule staminali pluripotenti indotte, ottenute a loro volta da cellule epidermiche umane prese tramite biopsia.

[Karumbayaram S, Lee P, Azghadi SF, Cooper AR, Patterson M, Kohn DB, Pyle A, Clark A, Byrne J, Zack JA, Plath K, Lowry WE. From skin biopsy to neurons through a pluripotent intermediate under Good Manufacturing Practice protocols. Stem Cells Transl Med. 2012 Jan;1(1):36-43. doi: 10.5966/sctm.2011-0001. Epub 2011 Dec 7.]

Abstract:

“The clinical application of human-induced pluripotent stem cells (hiPSCs) requires not only the production of Good Manufacturing Practice-grade (GMP-grade) hiPSCs but also the derivation of specified cell types for transplantation under GMP conditions. Previous reports have suggested that hiPSCs can be produced in the absence of animal-derived reagents (xenobiotics) to ease the transition to production under GMP standards. However, to facilitate the use of hiPSCs in cell-based therapeutics, their progeny should be produced not only in the absence of xenobiotics but also under GMP conditions requiring extensive standardization of protocols, documentation, and reproducibility of methods and product. Here, we present a successful framework to produce GMP-grade derivatives of hiPSCs that are free of xenobiotic exposure from the collection of patient fibroblasts, through reprogramming, maintenance of hiPSCs, identification of reprogramming vector integration sites (nrLAM-PCR), and finally specification and terminal differentiation of clinically relevant cells. Furthermore, we developed a primary set of Standard Operating Procedures for the GMP-grade derivation and differentiation of these cells as a resource to facilitate widespread adoption of these practices.”

Nel testo, leggiamo:

“Here, we report that patient-specific neural progenitor cells (NPCs) and neurons can be derived from hiPSCs using methods that are completely devoid of xenobiotics and are GMP-compatible. These approaches apply novel techniques to derive fibroblasts from patients, reprogram them to a pluripotent state, and then differentiate them to NPCs and neurons, all in completely defined media and without animal products or feeder cells.”
[…]
“We procured xenobiotic-free cell culture reagents for the cell culture needed for the stages from derivation of fibroblasts from skin biopsies to their reprogramming into hiPSCs and the differentiation to NPCs, neurons, and glia.”
[…]
“NPCs are capable of generating both neurons and glial cells.”
[…]
“To our knowledge, this is the first description of procedures necessary to take patient biopsies and generate NPCs, neurons, and glia through a pluripotent intermediate in the complete absence of either xenobiotics or feeder cells, with commercially available reagents. As new xeno-free media formulations, and even clinical grade feeders, are now regularly brought to market, it is possible that the conditions used here are not the only feasible methods to achieve this end. This is the first report to document the site of integration for the reprogramming factors after xeno-free reprogramming and demonstrate that such integrations can be benign. As a result, this work can serve as a starting point for clinical application of hiPSCs. The presentation here of clinical-grade SOPs could help to ensure that these methods are applied consistently and appropriately.”

Full Text: http://stemcellstm.alphamedpress.org/content/1/1/36.full
Pdf: https://www.stemcell.ucla.edu/sites/default/files/Xfipsc_Paper_sctm.2011-0001.pdf

Pacemaker: si possono testare solo su animali?

Recentemente persone favorevoli alla sperimentazione animale hanno affermato che non esisterebbero metodi alternativi agli animali per testare pacemaker e dispositivi medici.

Tra i loro argomenti vi sono:
1) critica all’uso di cadaveri perfusi
2) critica all’uso di manichini
3) critica all’uso di metodologie in vitro per testare la biocompatibilità dei dispositivi medici.

Partiamo dal primo punto:
I pro-SA affermano:
“il danno a livello cardiaco si configura molto presto: entro 2-3 ore inizia il fenomeno dell’apoptosi, ovvero della morte programmata delle cellule in seguito alla carenza di ossigeno parziale (danno ischemico) o totale (infarto), e successivamente inizia il fenomeno della necrosi, la morte cellulare a causa di insulti di varia natura. Tutti questi fenomeni alterano e distruggono il tessuto cardiaco in modo definitivo, provocandone il deterioramento e la perdita di funzione da parte del cuore. L’estensione del danno dipende poi dalla causa dell’ischemia/infarto e dalla capacità di compenso del sistema vascolare (dei vasi che irrorano il tessuto cardiaco).
E’ alquanto particolare quindi ritenere che il cuore di un cadavere sia in perfette condizioni per poter essere utilizzato negli studi dei dispositivi pacemaker, in quanto soggetto ai fenomeni sopra descritti. Se fosse poi riperfuso, ovvero se fosse ripristinata la circolazione all’interno del cuore, si avrebbe il cosiddetto danno da riperfusione che consiste nel danno diretto da parte di specie reattive dell’ossigeno (radicali liberi) che danneggiano la membrana cellulare, le proteine e  il DNA delle cellule, accelerandone la morte. Un danno sopra il danno insomma!”

Usare animali per testare pacemaker, cioè fare uso del modello animale, non è la soluzione ideale, infatti la stessa anatomia tra un cuore umano e quello animale è diversa, esistono inoltre differenze più specifiche dovute all’appartenenza a specie diverse, ad esempio: adesione piastrinica, trombosi ed emolisi tendono ad accadere più velocemente nelle specie canine che negli umani [1].
Alcuni ricercatori della Washington University, a seguito dei risultati di studi pubblicati sul Journal of Molecular and Cellular Cardiology [2][3], hanno affermato: 

”Il problema è che, almeno nel campo dell’aritmia cardiaca, il paradigma di questo modello animale ha avuto ben pochi successi. Studio clinico dopo studio clinico si sono conclusi con fallimenti. […] Il cuore di un topo batte circa 600 volte al minuto, quindi potete immaginare che è un po’ diverso dagli esseri umani, il cui cuore batte in media 72 volte al minuto. […] Si può mutare nei topi il gene che si pensa possa causare insufficienza cardiaca negli esseri umani e comunque non si otterrà la stessa malattia, perchè il topo è alquanto diverso. Da quando abbiamo iniziato a lavorare con i cuori umani, finalmente stiamo cominciando a recuperare il ritardo maturato con la fisiologia animale.”[4]

In aggiunta, l’uso di cadaveri perfusi ha già sostituito efficacemente gli animali nella didattica chirurgica e ha la possibilità di farlo nella microchirurgia, leggiamo infatti:

“We developed a new model utilising human cadavers that can replace the use of live anaesthetised animals for surgical training.
The vessels in a cadaveric specimen were connected to artificial blood reservoirs. The arterial side was connected to a pump to provide pulsating pressure inside the arteries, while the venous side was kept under static pressure that applied to the reservoir.

This method provides a condition that simulates live surgery in terms of bleeding, pulsation and liquid filling of the vascular tree. It is an excellent alternative model and can be applied to the whole cadaver or to a particular cadaveric specimen (head, arm, leg) or to an isolated organ. It is distinctive and of a great practical value for training in a wide range of surgical procedures, Utilising this technique could forever eliminate the use of live anaesthetised animals for surgical training.”

Si dimostrano infatti più attendibili degli animali nelle tecniche operatorie:

“One cadaveric specimen provides an opportunity for numerous training procedures. Trainees can practise on the same specimen for an extended time, as long as the specimen is preserved, in addition to the advantages of practising on the real human anatomy, while training on anaesthetised animals allows time for only a few procedures, on a strange and different anatomy.“
[…]
“Live anaesthetised animals may provide a similar situation to live surgery (bleeding, pulsation and soft, oozing tissues), but in a different anatomy, and for only a short period of time before the animal expires.” [5]

Addirittura i cadaveri umani sono il modello più vicino all’uomo vivente in ambito chirurgico, sebbene manchino dei fattori emodinamici, carenza a cui si può però rimediare, come già detto prima, grazie alla perfusione del cadavere:

“Human cadaver models are especially beneficial because they are the closest to live surgery with the greatest disadvantage of lacking hemodynamic factors.”[6]

A volte per sostituire il modello animale , accettato come metodo scientifico da usare anche se non rappresentativo dell’essere umano, c’è bisogno di una strategia integrata che unisca più metodi scientifici avanzati che forniscono risposte su processi diversi.

In questo caso vengono in aiuto ai ricercatori i metodi in vitro.
Ad esempio, per testare le eventuali interferenze elettromagnetiche tra elettrobisturi e dispositivi medici cardiaci, sono stati utilizzati questi tipi di test, leggiamo infatti dalla pubblicazione di uno studio:

“MATERIALS AND METHODS: Using a collagen-based saline gel, three implantable pulse generators (pacemakers) and three implantable cardioverter defibrillators were tested to measure the EMI from two commonly used hyfrecators. The six devices were tested using the hyfrecator under normal use settings and on maximum power.
[…]
CONCLUSION: Hyfrecators are safe to use in patients with defibrillators and can be used in pacemaker patients within 2 inches of the device perimeter.”[7].

Riportiamo in aggiunta un articolo del “Journal Watch Dermatology” riguardante questo esperimento, in grado di spiegare in maniera migliore come siano riusciti a simulare l’ambiente cardiaco per l’operazione:

“To assess the electromagnetic interference potential of these devices and possible problems in patients with cardiac rhythm management devices, these investigators simulated hyfrecator cutaneous surgery in a simulated cardiac environment.
The simulated cardiac environment consisted of a collagen-based saline gel with resistivity similar to human soft tissue, three implantable pulse generators (pacemakers), and three implantable cardioverter defibrillators.”[8].

In un altro esperimento, riguardante la valutazione dell’interferenza elettromagnetica tra i dispositivi cardiaci e i sistemi oftalmici laser, è stata utilizzata una camera toracica simulata, leggiamo dalla pubblicazione:

“Two implantable devices, one Victory dual-chamber IPG (St Jude Medical, Minneapolis, MN, USA) and one Atlas II + dual-chamber ICD (St Jude Medical), were consecutively placed in a simulated th
oracic chamber and exposed to three ophthalmic laser systems: the VISX Star S4 Excimer Laser, Lumenis Selecta II 532 neodymium-doped yttrium aluminium garnet (Nd:YAG) laser, and Ellex Ultra Q 1064 nm Nd:YAG laser. […] The pacing and defibrillation function of the implantable devices, including electrograms, were continuously monitored. […] The devices were placed in simulated thoracic chambers. The two test chambers consisted of plastic containers measuring 8 in. × 11 in. × 4 in. The Victory IPG was connected to two Tendril DX™ model 1388T pacing leads. The Atlas II + ICD was connected to a Tendril DX™ 1488 in the atrial port. The Riata model 1580 ICD true bipolar and Riata i™ model 1590 integrated bipolar leads were used during the testing in the ventricular port. The devices were placed in foam blocks to stabilize the leads in a position simulating the orientation and implant position as they would be in a patient. The distance between the high-voltage power supply of the laser systems and the CIEDs was <36 in. The devices were immersed in the saline test bath. The test containers were filled with distilled water and NaCl producing a pacing impedance of ∼500 Ω. This in vitro test model is the standard method to evaluate electromagnetic compatibility for implantable pacemakers and defibrillators.” [9]

Anche un’ulteriore pubblicazione,  “In vitro tests reveal sample radiofrequency identification readers inducing clinically significant electromagnetic interference to implantable pacemakers and implantable cardioverter-defibrillators”, viene riportato lo stesso metodo utilizzato in precedenza:

“Methods
During in vitro testing, 15 implantable pacemakers and 15 ICDs were exposed to 13 passive RFID readers in 3 frequency bands: 134 kHz (low frequency [LF]), 13.56 MHz (high frequency [HF]), and 915 MHz (ultra high frequency [UHF]).”[10]

Infatti nella figura 1 [http://ars.els-cdn.com/content/image/1-s2.0-S1547527109011461-gr1.jpg] viene mostrato un simulatore del dorso umano su cui testare questi dispositivi:

Questo modello è utile anche per la ricerca sul comportamento elettrochimico di stimolazione/sensing dei materiali per l’applicazione degli elettrodi del pacemaker, leggiamo infatti:

“The electrochemical behavior, interfacial properties, and stability of Pt, Ti, smooth and rough TiN electrodes for pacemaker applications were investigated in a phosphate-buffered saline solution, by electrochemical impedance spectroscopy and cyclic voltammetry (CV), as well as surface analysis using scanning electron microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy.”[11]

Pertanto, attraverso un simulatore di tronco che riproduca le costanti elettriche caratteristiche dei tessuti biologici umani, è possibile valutare la compatibilità elettromagnetica del pacemaker, in accordo con lo standard internazionale ANSI/AAMI PC69:2007.
La compatibilità elettromagnetica del pacemaker deve infatti venir verificata, ad ogni frequenza, sia in modalità pacing che sensing. Nel primo caso, il pacemaker lavora in modo tale da fornire una stimolazione continua ad una frequenza fissa e l’esposizione al campo elettromagnetico non deve alterare questa condizione di lavoro. In modalità sensing, invece, sugli elettrodi del simulatore di tronco viene applicato un segnale che riproduce l’attività fisiologica del cuore (segnale ECG); il pacemaker viene programmato in modo tale da poter riconoscere il segnale e deve interrompere la propria attività, senza subire interferenze da parte del campo elettromagnetico esterno. [12]

In aggiunta, si è scoperto come sia possibile stimolare elettricamente cardiomiociti utilizzando pacemaker, sebbene questo metodo sia stato utilizzato per scopi diversi da quelli di cui stiamo argomentando [13].
Dove generalmente vengono usate cellule di ratto, è possibile utilizzare cellule umane e cellule cresciute in un ambiente 3D, per queste ultime, ad esempio, leggiamo:

“To the authors’ knowledge, this is the first electro-mechanical bioreactor system to simulate the electrical and mechanical response of the myocardium in vivo.”[14]

E’ inoltre possibile utilizzare miocardiociti derivanti da cellule staminali embrionali:

“Cardiomyocyte monolayers (HL-1 cells) or embryonic stem cell-derived cardiomyocytes were used as two- and three-dimensional cardiac pacemaker models.” [15]

Infine, per quanto riguarda il tessuto umano, le colture organotipiche di tessuto cardiaco provenienti da adulti umani a seguito di operazioni chirurgiche, rappresentano un valido sostituto al tessuto animale, soprattutto a seguito di differenze nella composizione cellulare e subcellulare del miocardio tra le specie:

“Due to major differences in the cellular and subcellular composition of the myocardium between species, the use of human heart tissue is highly desirable. To enhance the experimental use of the human myocardium, we established methods for the preparation of vital tissue slices from the adult ventricular myocardium as well as conditions for their long-term preservation in organotypic culture.
Methods and resultsHuman ventricular heart samples were derived from surgical specimens excised during a therapeutic Morrow myectomy and cut into 300 μm thick slices. […] Viability and functionality were proven by viability staining, enzyme activity tests, intracellular potential recordings, and force measurements. […] Acute slices developed excitation-dependent contractions with a clear preload dependency and a β-adrenergic response. […]
Conclusion Organotypic heart slices represent a multicellular model of the human myocardium and a novel platform for studies ranging from the investigation of molecular interactions to tissue engineering.”

All’interno dell’articolo, leggiamo, sempre a proposito delle differenze specie-specifiche tra il miocardio umano e quello degli altri mammiferi, sebbene il fine per il quale tali modelli siano usati è diverso (sviluppo di farmaci):

“The development of cardiac drugs requires complex and functionally intact experimental models. Models of the myocardium that comprise an intact multicellular tissue composition have been based mainly on animal experiments or animal organ preparations (e.g. perfused hearts). However, due to major differences in the cellular and molecular properties of the myocardium between human and other mammalian species, data from such test systems are of limited significance for the human situation.” [16]

Passiamo brevemente al secondo punto: 

L’uso di manichini high-tech, sebbene abbia anch’esso delle limitazioni, potrebbe essere molto utile per quanto riguarda lo studio di tecniche operatorie necessarie all’impianto di pacemaker.
Non a caso, vengono già utilizzati per la didattica in diverse facoltà universitarie, tra cui quella di Medicina e Chirurgia dell’Università degli Studi di Roma Tor Vergata, grazie al CeSiMeT, e riportiamo dal loro sito:

“Sul lettino della sala operatoria virtuale del  Centro di simulazione medica e training – CeSiMet,  frutto della collaborazione tra l’Ateneo e la società Acaya, c’è un manichino-robot  in grado di simulare le condizioni di un paziente, di reagire agli stimoli e  alle terapie. Tutto grazie a un simulatore come quelli utilizzati in aeronautica: il manichino è in grado di parlare, lamentarsi, respirare e  anche di morire, in caso di intervento fallito o di cure non adeguate.
“Questo di Tor Vergata è  il  secondo Centro di simulazione  in una Università pubblica italiana,   dopo quello dell’ateneo di Perugia  –  spiega il preside della facoltà di Medicina Giuseppe Novelli  –   Gli studenti potranno  operare chirurgicamente, praticare un angioplastica o un massaggio cardiaco, effettuare visite ortopediche o urologiche e  mettere i punti di sutura in caso di ferite “virtuali”, senza alcun rischio per il paziente”.
A  gruppi di 4/5 si eserciteranno nella sala operatoria mentre  il resto della classe potrà seguire  le operazioni in aula attraverso un monitor e telecamere collegate con il  CeSiMet. A operazione finita il docente, insieme agli studenti,  analizzerà tutte le fasi  registrate da un computer collegato ai macchinari, correggendo gli eventuali errori.
La società Acaya e l’ateneo potranno rilasciare anche i patentini dell’American Heart Association per la prevenzione e la cura delle emergenze cardiache e respiratorie.”

Infine, passiamo ai test di biocompatibilità in vitro:
I pro-SA affermano: “L’articolo in questione si limita evidenziare la presenza di alcuni test di screening iniziale per valutare la compatibilità dei soli materiali impiegati dal punto di vista della citotossicità e della emocompatibilità.”

L’articolo invece parla di biocompatibilità di biomateriali e dispositivi medici. La biocompatibilità è l’attitudine di un materiale ad essere ben tollerato dall’organismo ospite in cui deve operare, determinando una risposta opportuna in relazione all’applicazione da parte di quest’ultimo. I biomateriali usati come dispositivi medici devono essere testati prima della loro introduzione, in modo tale che ogni effetto negativo sul corpo umano sia conosciuto e prevenuto, e ciò è possibile farlo grazie anche a queste tecnologie.

Citando la pubblicazione, ma non essendo presente nel testo originale, i pro-SA affermano: “allo stato attuale per poter testare i dispositivi pacemaker non abbiamo altri mezzi se non l’utilizzo del modello animale che permette di avere a disposizione un modello biologico che rappresenta molto bene il cuore umano dal punto di vista fisiologico.”

Al contrario lo stesso articolo afferma, a dispetto della loro affermazione sul modello animale che a dir loro “rappresenta molto bene il cuore umano”:

“ISO 10993-4 requires that human blood is used for in vitro tests where possible because of species differences in blood reactivity. Pig and baboon are suitable animal models, but species differences may be significant; for example, platelet adhesion, thrombosis and haemolysis tend to occur more readily in the canine species than in the human. Thus, all results of animal studies should be interpreted with cautionbecause they run the risk of misjudgement.”[1]

Infatti il paper a cui si riferiscono (Müller U., In vitro biocompatibility testing of biomaterials and medical devices. Med Device Technol. 2008 Mar-Apr;19(2):30, 32-4) afferma che vi siano differenze nel sangue tra animali e umani tali da obbligare l’uso nei test in vitro di sangue umano per evitare le differenze tra specie tra uomo e animale, come per esempio processi come l’adesione piastrinica, l’emolisi o le trombosi, processi che avvengono in tempi diversi a seconda delle specie e quindi non utili per l’uomo. Müller specifica che i risultati su studi in animali devono essere “interpretati con cautela” perchè incorrono nel “rischio di essere erroneamente giudicati”.

Inoltre, in un’ulteriore pubblicazione riguardante la biocompatibilità in vitro, i risultati ottenuti usando questa metodologia vengono definiti maggiormente riproducibili e predittivi di quelli ottenuti da studi in vivo (su animali):

“By definition, a biocompatible biomaterial does  not  have  toxic  or  injurious  effects  on  biological  systems. […] In vitro toxicity examinations are more favorable than those performed in vivo, as the results are  more reproducible and predictive. In this paper, basic in vitro tools were used to evaluate cellular and molecular responses with regard to the biocompatibility of biomedical-grade chitosan.  Three  paramount  experimental  parameters  of  biocompatibility  in  vitro namely cytocompatibility,  genotoxicity  and  skin  pro-inflammatory  cytokine  expression, were generally reviewed for biomedical-grade chitosan as wound dressing.”[17]

La ricerca sui metodi alternativi sostitutivi nell’area dei biomateriali e dispositivi medici è un area in continuo sviluppo, per legge un nuovo materiale o dispositivo per essere approvato all’utilizzo clinico deve seguire la  “Medical Device Directive” (Council Directive 93/42/EEC of 14 June 1993 concerning medical devices) e la “Active Implantable Medical Device Directive” (“Council Directive 90/385/EEC of 20 June 1990 on The Approximation of The Law of the Member States Relating to Active Implantable Medical Devices”), che definiscono i requisiti della valutazione clinica dei dispositivi medici, mentre per controllare la biocompatibilità di un prodotto o i suoi componenti si segue la ISO 10993. I biomateriali usati nei dispositivi medici devono essere testati in accordo con la ISO 109931 prima della loro introduzione nel corpo del paziente così che ogni effetto negativo sul corpo venga conosciuto e prevenuto, ma come gli autori specificano usando test di laboratorio in vitro, “pericoli per i pazienti ed esperimenti su animali non necessari possono essere evitati” (“By using in vitro laboratory tests, dangers for patients and unnecessary animal experiments can be avoided”). A questo fine più branche della ricerca possono unire le loro conoscenze ed applicarle a problemi specifici, per esempio colture cellulari 3D e bioreattori multicompartimentali modulari potrebbero essere usati per studiare interazioni tra il sangue umano e il biomateriale da testare e i cambiamenti nella qualita’ dei componenti del sangue (eritrociti, leucociti, trombociti etc) e biomarkers di infiammazione si potrebbero analizzare attraverso test di biologia molecolare applicati a devices più complessi che misurano la durata del contatto e le reazioni da contatto del sangue al device in esame, in questo caso un sistema dinamico, come quello fornito da bioreattori modulari multicompartimentali, potrebbe essere utile per analizzare più parametri in un sistema fluidico e dinamico, simile alla circolazione sanguigna nell’uomo. 

 

Note:

[1] Müller U. In vitro biocompatibility testing of biomaterials and medical devices. Med Device Technol. 2008 Mar-Apr;1
9(2):30, 32-4.

[2] Glukhov AV, Flagg TP, Fedorov VV, Efimov IR, Nichols CG. Differential K(ATP) channel pharmacology in intact mouse heart. J Mol Cell Cardiol. 2010 Jan;48(1):152-60. doi: 10.1016/j.yjmcc.2009.08.026. Epub 2009 Sep 8.

[3] Fedorov VV, Glukhov AV, Ambrosi CM, Kostecki G, Chang R, Janks D, Schuessler RB, Moazami N, Nichols CG, Efimov IR. Effects of KATP channel openers diazoxide and pinacidil in coronary-perfused atria and ventricles from failing and non-failing human hearts. J Mol Cell Cardiol. 2011 Aug;51(2):215-25. doi: 10.1016/j.yjmcc.2011.04.016. Epub 2011 May 7.

[4] Diana Lutz. New study calls into question reliance on animal models in cardiovascular research. Human hearts respond differently than mouse hearts to two cardiovascular drugs, August 3, 2011. Washington University in St. Louis.

[5] Aboud E, Suarez CE, Al-Mefty O, Yasargil MG. New alternative to animal models for surgical training. Altern Lab Anim. 2004 Jun;32 Suppl 1B:501-7.

[6] Olabe J, Olabe J, Sancho V. Human cadaver brain infusion model for neurosurgical training. Surg Neurol. 2009 Dec;72(6):700-2. doi: 10.1016/j.surneu.2009.02.028. Epub 2009 Aug 6.

[7] Weyer C, Siegle RJ, Eng GG. Investigation of hyfrecators and their in vitro interference with implantable cardiac devices. Dermatol Surg. 2012 Nov;38(11):1843-8. doi: 10.1111/j.1524-4725.2012.02526.x. Epub 2012 Aug 13.

[8] Murad Alam. Hyfrecators: No In Vitro Interference with Implantable Cardiac Devices. Journal Watch Dermatology February 22, 2013.

[9] Sher NA, Golben MP, Kresge K, Selznick L, Adabag S. An in vitro evaluation of electromagnetic interference between implantable cardiac devices and ophthalmic laser systems. Europace. 2011 Apr;13(4):583-8. doi: 10.1093/europace/euq495. Epub 2011 Jan 19.

[10] Seidman SJ, Brockman R, Lewis BM, Guag J, Shein MJ, Clement WJ, Kippola J, Digby D, Barber C, Huntwork D. In vitro tests reveal sample radiofrequency identification readers inducing clinically significant electromagnetic interference to implantable pacemakers and implantable cardioverter-defibrillators. Heart Rhythm. 2010 Jan;7(1):99-107. doi: 10.1016/j.hrthm.2009.09.071. Epub 2009 Oct 12.

[11] Norlin A, Pan J, Leygraf C. Investigation of electrochemical behavior of stimulation/sensing materials for pacemaker electrode applications. J Electrochem Soc. 2005;152:J7–J15.

[12] Eugenio Mattei, Giovanni Calcagnini, Federica Censi, Michele Triventi, Antonello Delogu, Pietro Bartolini. Semi-automatic system to test the electromagnetic compatibility of a pacemaker according to the standards EN 45502-2-1:2004 e ANSI/AAMI PC69:2000. Istituto Superiore di Sanità 2007, 26 p. Rapporti ISTISAN 07/21 (in Italian)

[13] Martherus RS, Zeijlemaker VA, Ayoubi TA. Electrical stimulation of primary neonatal rat ventricular cardiomyocytes using pacemakers. Biotechniques. 2010 Jan;48(1):65-7. doi: 10.2144/000113308.

[14] Feng Z, Matsumoto T, Nomura Y, Nakamura T. An electro-tensile bioreactor for 3-D culturing of cardiomyocytes. A bioreactor system that simulates the myocardium’s electrical and mechanical response in vivo. IEEE Eng Med Biol Mag. 2005 Jul-Aug;24(4):73-9.

[15] Fahrenbach JP, Mejia-Alvarez R, Banach K. The relevance of non-excitable cells for cardiac pacemaker function. J Physiol. 2007 Dec 1;585(Pt 2):565-78. Epub 2007 Oct 11.

[16] Brandenburger M, Wenzel J, Bogdan R, Richardt D, Nguemo F, Reppel M, Hescheler J, Terlau H, Dendorfer A. Organotypic slice culture from human adult ventricular myocardium. Cardiovasc Res. 2012 Jan 1;93(1):50-9. doi: 10.1093/cvr/cvr259. Epub 2011 Oct 4.

[17] Keong LC, Halim AS. In vitro models in biocompatibility assessment for biomedical-grade chitosan derivatives in wound management. Int J Mol Sci. 2009 Mar;10(3):1300-13. doi: 10.3390/ijms10031300. Epub 2009 Mar 18.

[C.N.][A.C.]

Body-on-a-chip

[Williamson A, Singh S, Fernekorn U, Schober A. The future of the patient-specific Body-on-a-chip. Lab Chip. 2013 May 20.]

Abstract:

“Siccome i progressi significativi nella tecnologia focalizzata sugli Organ-on-a-chip continuano, è possibile prendere in considerazione il futuro della tecnologia Body-on-a-chip. Con il serio lavoro svolto per realizzare il funzionamento di fegati, reni, cuore e polmoni artificiali su chip, il passo successivo è non solo interconnettere questi organi, ma anche prendere in considerazione l’integrazione della tecnologia delle cellule staminali per creare organi interconnessi paziente-specifici. Questo Body-on-a-chip paziente-specifico richiede un sofisticato insieme di strumenti per il micropattering di colture cellulari in 3D per creare strutture interconnesse di organi simil-tissutali. Questa review discute dei metodi avanzati degli ultimi due anni negli organi on-Chip, il complesso patterning 3D di colture e di  scaffolding state-of-the-art e discute alcune delle innovazioni più rilevanti nella ricerca sulle cellule staminali umane pluripotenti indotte (hiPSC) applicata a questi organi e ponteggi per il futuro di un Body-on-a-chip paziente-specifico. Possiamo anticipare che una simile tecnologia avrebbe una vasta area di applicazione, soprattutto beneficiando lo sviluppo dei farmaci, i test di sicurezza delle sostanze chimiche, e la modellazione delle malattie.”

Guida alla sperimentazione animale FOR DUMMIES (e non vi offendete!)

In questa sede commenteremo uno scritto del gruppo pro-SA “Pro-Test Italia”, “Guida alla Sperimentazione Animale per tutti”, riprendendo i vari errori che vi sono contenuti.

Iniziamo subito citando dall’articolo dei pro:
“Per prima cosa, dovete sapere che, sì, è vero, la percentuale di farmaci che vengono rigettati prima della sperimentazione sugli uomini è alta… Ma non perché gli studi siano inattendibili, semplicemente perché la selezione è dura e ha molti passaggi.”
Questa però è una contraddizione in termini, perchè la selezione è dura? Semplicemente perchè nella maggior parte delle volte il risultato ottenuto in fase preclinica non è traslabile all’uomo.

“Qui stanno i motivi per cui le colture cellulari sono insufficienti. Infatti, quando tu assumi un farmaco, questo deve entrare nel sangue, e sarà il sangue a portarlo alla sua destinazione finale. Ma il sangue arriva ovunque nel corpo. Prima di tutto, arriva al fegato, che può modificarne la struttura chimica, rendendolo, appunto, più attivo, più inattivo o tossico… Ed io naturalmente ho bisogno di sapere come il fegato lo trasformerà, perché in base a questo posso sistemare io stessa la struttura chimica del farmaco, aggiungendo o togliendo qualcosa, di modo che il farmaco passi il fegato attivo e non tossico. Inoltre, quello che può fare bene ad un organo o a una cellula potenzialmente può far male ad un altro… Questo è il motivo degli effetti collaterali. […] Ora, io ti chiedo: come fai a studiare tutto questo senza il sangue, senza il fegato, senza le barriere e senza i reni collegati con l’organo target?” 
Se il problema è raggiungere altri organi, può essere risolto grazie alle co-colture o ai bioreattori multi-compartimentali.
Un esempio del primo caso è costituito dalle Co-colture Integrate Discrete Multiorgano (IdMOC), che sono dei nuovi sistema sperimentali in vitro che permettono la valutazione degli effetti biologici di sostanze chimiche, con interazioni tra più tipi di cellule tra cui interazioni endocrine, paracrine e metaboliche. Un’applicazione specifica della IdMOC è la valutazione delle proprietà chimiche dipendenti dal metabolismo, come la tossicità e la farmacologia dipendenti dal metabolismo. 
Come già detto, infatti, le proprietà in vivo che non sono ben rappresentate in vitro includono risposte organo-specifiche, metabolismo di più organi, e interazioni tra più organi. Il sistema IdMOC è stato sviluppato proprio per affrontare queste carenze. Il sistema utilizza un concetto ‘wells-within-a-well’ per la co-coltura di cellule o fette di tessuto di diversi organi come entità fisicamente separate (discrete) nei pozzetti interiori. Questi pozzi interni sono comunque interconnessi (integrati) mediante coltura sovrastante. Il sistema ldMOC modella così la situazione in vivo, in cui più organi sono fisicamente separati ma interconnessi dalla circolazione sistemica, permettendo interazioni multiple di organi.
Per quanto riguarda invece i bioreattori multi-compartimentali modulari (McmB), si tratta di sistemi innovativi per colture cellulari dinamici e co-colture. La camera modulare è progettata con forma e dimensioni simili al sistema di pozzetti multipli 24-MultiWell, e consiste di una camera di coltura cellulare in polimero di silicio. Le camere modulari possono essere collegate anche loro in serie o in parallelo, come desiderato, al fine di replicare le comunicazioni tessuto/tessuto e tessuto/organi e di ricreare modelli in vitro di metabolismo o malattie utilizzando l’approccio organomico.
Un esempio di McmB è rappresentato da Quasi-Vivo®, un sistema che consente di coltivare più tipi di cellule in camere di coltura interconnesse. Il flusso di sostanze nutritive tra le camere permette di simulare diverse vie metaboliche per indagare e testare modelli biologici multi-compartimentali in vitro.

“E allora perché riteniamo attendibili i risultati sulle cavie? Be’, perché in realtà a ben guardare le somiglianze sono più delle differenze.”
Ciò tuttavia non corrisponde al vero, infatti, per fare un esempio, nonostante abbiamo in comune il 98-99% del nostro DNA con lo scimpanzè (la specie geneticamente più vicina a noi), questa differenza dell’1-2% diventa un 80% di discordanza nel passaggio da geni a proteine. [Glazko G, Veeramachaneni V, Nei M, Makałowski W. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene. 2005 Feb 14;346:215-9.]

Questo si ricollega alla successiva affermazione dei pro-SA:
“Per la verità, moltissimi fenomeni nel topo avvengono in modo straordinariamente simile a come avvengono negli esseri umani…”
Infatti una somiglianza superficiale non tiene conto delle infinite differenze che vi possono essere a livello di proteine, metabolismo, permeabilità intestinale, anatomia, ecc.

“E questo perché,a dispetto di quel che sembra dire l’aspetto,evolutivamente parlando siamo molto vicini”
Peccato che l’evoluzione non comporti solo somiglianze, anzi! Cito infatti da
Lynch VJ. Use with caution: developmental systems divergence and potential pitfalls of animal models. Yale J Biol Med. 2009 Jun;82(2):53-66. :
“[…] l’ipotesi che le funzioni geniche e i sistemi genetici siano conservati tra i modelli e gli esseri umani è data per scontata, spesso a dispetto di prove che le funzioni e le reti geniche divergono nel corso dell’evoluzione. In questa recensione, discuto alcuni meccanismi che generano divergenza funzionale e metto in evidenza esempi recenti che dimostrano che le funzioni geniche e le reti di regolazione divergono nel tempo. Questi esempi suggeriscono che l’annotazione di funzioni geniche basate esclusivamente su fenotipi mutanti nei modelli animali, così come le assunzioni di funzioni conservate tra le specie, possono essere sbagliate. Pertanto, i modelli animali di funzioni geniche e di malattie umane non possono fornire informazioni adeguate, in particolare per la rapida evoluzione di geni e sistemi.” 

Nuovamente i pro-SA affermano:
“Chiariamo ora un altro punto: il genoma non c’entra niente. O meglio: per infilarcelo bisogna prendere l’argomento molto alla lontana. Infatti, il genoma non è altro che l’insieme dei geni di una specie.In pratica, si tratta di una sorta di libretto di istruzioni per far funzionarel a cellula e l’organismo. I geni sono le parole del libretto di istruzioni,formati da delle lettere che sono i nucleotidi: adenina, timina,citosina e guanina. Ma, appunto, è solo un libretto di istruzioni: per quanto importante,non è lui che svolge i vari compiti all’interno della cellula. In una cellula sono le proteine che agiscono per svolgere un compito, e il genomaserve per sapere come costruirle.”
Infatti, come già detto, differiamo a livello proteico dallo scimpanzè, la specie geneticamente più vicina a noi, per ben l’80%, immaginiamo quanto può essere ampia la differenza con un topo o un ratto!
Tuttavia è indubbio che differenze a livello genetico spesso si traducano in differenze a livello funzionale, pertanto l’argomento non è da scartare, e sempre in questo campo, vi sono fattori che rendono gli animali ancora più diversi da noi, tra cui: la possibile perdita o acquisizione di determinati geni durante l’evoluzione, l’alterazione di geni o cromosomi, le differenze rispetto alle forme di uno stesso gene, la presenza di pseudogeni (geni che hanno perso la loro funzione nel corso dell’evoluzione), trasferimento genico orizzontale, splicing alternativo, a
cquisizione di nuove funzioni da parte di vecchi geni, diversità di geni per svolgere la stessa funzione, regolazione ed espressione di geni in modo diverso in relazione agli stimoli ambientali, influssi epigenetici e miRNA, differenze nelle reti di regolazione genica, cambiamento dei profili di espressione genica, differenze rispetto alle proteine, alla loro attività o alla loro interazione; differenze per quanto riguarda l’esposizione ai fattori ambientali e diversa storia evolutiva.

“La maggior parte delle malattie per cui prendiamo farmaci non c’entrano poi granché col DNA perché vengono dall’esterno(da virus e batteri) o da stili di vita errati (come molte cardiopatie, ad esempio) o da incidenti di vario tipo. Ora, pensare di testare un farmaco per questi tipi di fenomeni solo con esperimenti di tossicogenomica è quantomeno miope.”
In primis, la tossicogenomica cerca di collegare cambiamenti indotti nell’espressione genica con le classi di composti tossici, non è solo l’analisi delle predisposizioni genetiche alle malattie come sembra voler far intendere l’autore dell’articolo.
Inoltre questo metodo, nella sostituzione dell’animale, non deve rimanere isolato, ma venire integrato con altre metodologie in modo da poter dare un quadro completo della situazione.

“Infine, mi aspetto la domanda: ma non si può prendere cellule umane di ogni organo e testare su quelle l’effetto che avrebbe il farmaco, di modo da non dover somministrare il farmaco all’individuo per vedere l’effetto su fegato, reni etc. etc.? Ni. Cioè, si può fare… Ma non è esaustivo.Infatti, le cellule si parlano tra loro. Si scambiano ioni e neurotrasmettitori(un esempio sono i neuroni), ormoni, cibo, molecole segnale… Questi sono messaggi in codice. Le cellule di un organismo pluricellulare non sono entità separate le une dalle altre, autosufficienti e che si fanno i fatti loro: le cellule collaborano tra loro per svolgere dei compiti, e se separate le une dalle altre non funzionano.”
Ed è proprio per questo che non si devono prendere colture isolate, bensì utilizzare co-colture o sistemi come i McmB che ricreino le interconnessioni tra le varie cellule e le interazioni organo-organo. 
Proprio in virtù di questo principio, il Wyss Institute di Harvard, uno dei massimi centri di bioingegneria del mondo, sta spendendo ingenti somme per lo sviluppo di Organ-on-a-chip, chip microfluidici che simulano l’attività, la risposta meccanica e la fisiologia di organi o sistemi, al fine di ricreare un vero e proprio “Body-on-a-chip”, nel quale tutti gli organi sono interconnessi al fine di simulare correttamente e completamente l’intero range delle risposte possibili da parte di un organismo umano.
In aggiunta, se, come dimostrato dallo studio MEIC, eseguito per verificare la capacità predittiva delle colture cellulari rispetto agli animali nei test di tossicità sulla base di alcuni dati noti di tossicità di alcune sostanze sull’uomo, una batteria di tre saggi su colture di cellule umane è maggiormente predittiva, economica e pratica degli studi condotti su animali, l’utilizzo di queste nuove tecnologie, l’uso di modelli tridimensionali e la replica in vitro delle interazioni organo-organo sicuramente aumenterebbero la predittività degli studi preclinici.

“E quindi? Dobbiamo arrenderci? No. Bisogna continuare a cercare metodi alternativi.”
Certo, se poi però certi metodi aspettano la validazione da anni, se si validano i nuovi test partendo dai modelli animali mai validati piuttosto che con meta-analisi retrospettive, se ci si concentra su fantomatici metodi alternativi con le cellule epidermiche di topo (http://www.eurekalert.org/pub_releases/2013-03/acs-ntf032713.php) e se gli enti atti alla validazione impiegano 10 anni per ogni metodologia da valutare, allora non avremo mai un cambiamento reale, a dispetto ovviamente della salute e della sicurezza dei volontari umani.

“Al momento il più promettente di questi metodi teorizzati sono le “colture organo tipiche”.In pratica, ad oggi si prende un organo, si fanno delle fettine e si cerca di farlo sopravvivere fuori dal corpo, così da potervi agire per le sperimentazioni…però si è teorizzato che magari un giorno si potrebbe tentare di far crescere direttamente questo tessuto a partire dalle cellule staminali tipiche di quel tessuto stesso, quindi senza prendere l’organo da un animale.”
In primo luogo, il più promettente per chi e secondo quale principio?
In secondo luogo, non è necessario l’uso di animali, basta fare una breve ricerca su pubmed scrivendo “human organotypic culture” e ci si accorge che ve ne sono tantissime che utilizzano tessuti umani, certamente è un settore da sviluppare, ma non con l’uso di modelli o derivati animali, dato che si andrebbe comunque a ricadere nell’errore di utilizzare un modello non-predittivo per l’uomo.

“Comunque le staminali dovranno essere prese da un animale. Magari da uno anziché da più d’uno, ecco.”
Perchè mai? Le cellule staminali pluripotenti indotte possono essere prese anche da esseri umani senza problemi e le cellule staminali embrionali sarebbero molto utili, inoltre, considerato che molti embrioni vengono congelati e sono destinati a morire nei congelatori, il problema etico neanche si pone. In questo senso, sarebbe opportuna una collaborazione tra pro- e anti-SA nella legalizzazione della ricerca su embrioni umani.

Sperimentazione animale e sviluppo di vaccini

In un articolo pubblicato nel 2011 su Nature-Immunology and Cell Biology, ricercatori australiani impegnati nello sviluppo di vaccini chiedono al proprio governo maggiori investimenti nella ricerca immunologica umana piuttosto che continuare a sovvenzionare la ricerca sui modelli di topi transgenici. Sebbene questo articolo non sia apertamente critico verso l’utilizzo di ”modelli animali”, ne riassume sostanzialmente la sempre più diffusa consapevolezza da parte della comunità scientifica dei loro seri limiti e della loro inaffidabilità in funzione della salute umana. In particolare, gli autori dell’articolo affermano chiaramente:

”L’uso dei modelli murini per studiare l’immunobiologia delle malattie infettive, come i virus della malaria e dell’herpes simplex, ha gravemente distorto la nostra comprensione del controllo immunitario di questi agenti patogeni nell’uomo e si potrebbe sostenere che il ricorso su questi sistemi di modello può aver rallentato il progresso nello sviluppo di vaccini efficaci contro numerosi agenti patogeni umani. La fiducia in questi sistemi di modello è erosa, dato che ora sappiamo che vi sono significative differenze nella fisiologia umana e le vie del sistema immunitario di regolamentazione di questi modelli animali. Infatti, il test clinico dell’anticorpo monoclonale anti-CD28 TGN1412 illustra lo molto bene.”

e anche:

“La scarsa traslazione degli studi nel modello murino nell’impostazione umana può essere spiegata da una serie di fattori. In primo luogo, la maggior parte dei studi svolti nei modelli murini sono condotti in ceppi di topi inbred, che possono drammaticamente deviare le risposte immunitarie. In secondo luogo, gli esseri umani e i topi mostrano numerose discrepanze sia nell’immunità innata che in quella adattativa, inclusi i sottogruppi di cellule T, recettori delle citochine, espressione e funzione di molecole di costimolazione, differenziazione di Th1/Th2, recettori Toll-like, le famiglie di recettori inibitori di NK Ly49 e KIR, e molti altri. Terzo, come sottolineato in precedenza, ha contribuito anche l’uso inadeguato di topi inbred come modelli di malattia/terapeutici per delineare percorsi regolatori immunitari o per testare nuove formulazioni di vaccini.”

Gli stessi autori prevedono che la grande collaborazione incentrata sugli studi dell’immunologia umana, proposta nell’articolo, sarà ostacolata dai sostenitori dello studio sull’immunologia dei modelli animali, ma chiedono:

”Per quanto tempo ancora possiamo giustificare il finanziamento di milioni di dollari di fondi dei contribuenti usati per delineare il sistema immunitario murino che in molti casi ha limitato l’applicazione per le malattie umane?”

Riportiamo di seguito un articolo pubblicato su Plos Medicine dal Dr. JJ Pippin, fondatore e direttore della medicina cardiovascolare e ”medical imaging” presso la ”Cooper Clinic”, autore e co-autore di oltre 60 articoli e abstract che sono stati pubblicati sulle principali riviste mediche, è stato anche portavoce e relatore presso la ”American College of Cardiology” e la ”Society of Nuclear Medicine, U.S.A.”, attuale consulente scientifico presso il Physicians Committee for Responsible Medicine (PCRM) degli U.S.A., un’associazione di medici, scienziati e laici che promuove la medicina preventiva e responsabile:

”Le uniche persone che non sanno, nel 2005, che la ricerca sugli animali è irrilevante per le malattie umane sono quelli che non lo capiscono o coloro che ne beneficiano. Come medico, ricercatore clinico, ed ex ricercatore animale, so che benchè siano i nostri parenti genetici più stretti, i primati hanno fallito come modelli di ricerca praticamente ogni volta che sono stati utilizzati a tale scopo.
Come elenco parziale di fallimenti, permettetemi di presentare i famigerati esperimenti forzati sul fumo, che hanno permesso alle sigarette di essere promosse ampiamente per decenni, o il misero fallimento di un quarto di secolo di ricerca sui primati sull’AIDS per fornire eventuali indicazioni utili, o ancora i depistaggi ed i vaccini pericolosi prodotti durante la ricerca sulla poliomielite (verificato da Albert Sabin stesso), il fallimento di studi sui primati per migliorare i rischi di difetti alla nascita e nascite premature, e il fallimento di studi sulle scimmie per identificare farmaci anti-infiammatori di rischio cardiovascolare.
I redattori di PLoS Medicine hanno espresso con linguaggio fiducioso che il vaccino contro la febbre di Lassa è riuscito in quattro scimmie, e, quindi, è un agente adatto per lo studio umano. Ricordiamo che il vaccino contro l’AIDS di VaxGen (AIDSVAX) ha mostrato grande successo negli studi sui primati, ma è stato un fallimento totale in due studi clinici, tra cui uno studio di oltre 2.500 iniezioni di farmaci in Thailandia ed un altro di una multinazionale di oltre 5.000 individui ad alto rischio.
Si consideri l’infruttuoso decennale sforzo per produrre un vaccino contro l’AIDS nei primati, la mancata produzione anche di un solo caso di AIDS umano in un qualsiasi studio su primate, o anche la mancata identificazione di un utile farmaco antiAIDS ottenuto da studi sui primati. Imperativi genetici e fisiologici impongono che non esistono modelli animali, anche tra i primati più elevati, che possano fornire informazioni applicabili agli esseri umani. Il Progetto Genoma Umano ci dice che vi è sufficiente diversità genetica tra gli esseri umani e che la farmacogenetica e le tecniche di farmacogenomica avranno un ruolo crescente nel superare i problemi legati alle polimorfismi ed alle altre varianti. Non possiamo nemmeno applicare le scoperte scientifiche in modo uniforme per gli esseri umani, e PLoS Medicine sta promuovendo la ricerca su scimmia?
Sono molto deluso dal fatto che PLoS Medicine è regredita a riportare la ricerca sugli animali. E’ scoraggiante che in questa epoca di rapido progresso biomedico, ed appropriata retrocessione della ricerca su animali nella pattumiera storica, PLoS abbia scelto di reintrodurre un anacronistico, medicalmente screditato, ed immorale strumento di ricerca per la sua segnalazione.”

Fonti:

1) [Dr Rajiv Khanna and Dr Scott R Burrows, Australian Centre for Vaccine Development, Queensland Institute of Medical Research, Human immunology: a case for the ascent of non-furry immunology, Nature-Immunology and Cell Biology (2011) 89, 330–331; doi:10.1038/icb.2010.173 –http://www.nature.com/icb/journal/v89/n3/full/icb2010173a.html]

2) [JJ Pippin, PLoS Takes a Step Backward, PLoS Med. 2005 August; 2(8): e278.
Published online 2005 August 30. doi: 10.1371/journal.pmed.0020278 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1196491/]

3) [Merck Research Laboratories. Electrical injury model of arterial and venous thrombus formation in the anesthetized African green monkey: Measurement of prothrombotic and antithrombotic effects. 2000]

4) [Barbour V, Cohen B, Yamey G. Some tolerance for fur—Animal studies in PLoS Medicine. PLoS Med. 2005;2:e203 – http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1160600/]

5) [McCarthy M. AIDS vaccine fails in Thai trial. Lancet. 2003;362:1728]

6) [McCarthy M. HIV vaccine fails in phase 3 trial. Lancet. 2003;361:755–756]

7) [Human Genome Project Information. Pharmacogenomics. Washington (DC): US Department of Energy Office of Science; 2005]

[A.L.]

Co-coltura Integrata Discreta Multiorgano (IdMOC)

[Aarti R. Uzgare and Albert P. Li New Paradigm in Toxicity Testing: Integrated Discrete Multiple Organ Co-cultures (IdMOC) for the Evaluation of Xenobiotic Toxicity. ALTEX: Current Proceedings: Vol 2, No. 1: 39-46]
Full Text: http://altweb.jhsph.edu/altex/proceedings/2_1/Uzgare2.pdf

Abstract:

Gli esseri umani sono esposti, intenzionalmente o meno, ad una serie di nuovi prodotti chimici a causa delle attività industriali. Vi è un’urgente necessità di valutare gli effetti biologici di queste nuove sostanze chimiche in modo efficiente e accurato. I programmi Tox21 e ToxCast ™ avviati dal National Institutes of Health (NIH) e dall’EPA raccomandano l’uso di metodi innovativi di analisi chimica per rispondere a questa domanda senza precedenti. L’iniziativa “Critical Paths” della US FDA enfatizza approcci sperimentali che siano direttamente traducibili in osservazioni cliniche. L’applicazione di high-throughput, saggi in vitro per delineare percorsi farmacologici e tossicologici in combinazione con la modellazione computazionale, rappresenta una delle strategie fondamentali per prevedere gli effetti chimici su animali ed esseri umani. La Co-coltura Integrata Discreta Multiorgano (IdMOC) è un nuovo sistema sperimentale in vitro che permette la valutazione degli effetti biologici di sostanze chimiche, con interazioni tra più tipi di cellule tra cui interazioni endocrine, paracrine e metaboliche.Un’applicazione specifica della IdMOC è la valutazione delle proprietà chimiche dipendenti dal metabolismo, come la tossicità e la farmacologia dipendenti dal metabolismo.

 

 

[Li AP. The use of the Integrated Discrete Multiple Organ Co-culture (IdMOC) system for the evaluation of multiple organ toxicity. Altern Lab Anim. 2009 Sep;37(4):377-85.]
Full Text: http://www.frame.org.uk/dynamic_files/li_final.pdf

Abstract:

L’applicazione del sistema di Co-coltura Integrata Discreta Multiorgano (IdMOC®) nella valutazione della tossicità organo-specifica è revisionata. Gli approcci in vitro per predire tossicità in vivo hanno avuto un successo limitato, soprattutto a causa della complessità delle reazioni tossiche in vivo. Le proprietà in vivo che non sono ben rappresentate in vitro includono risposte organo-specifiche, metabolismo di più organi, e interazioni tra più organi. Il sistema IdMOC è stato sviluppato per affrontare queste carenze. Il sistema utilizza un concetto ‘wells-within-a-well’ per la co-coltura di cellule o fette di tessuto di diversi organi come entità fisicamente separate (discrete) nei pozzetti interiori. Questi pozzi interni sono comunque interconnessi (integrati) mediante coltura sovrastante media nella grande caldaia contenente pozzi. Il sistema ldMOC modella così la situazione in vivo, in cui più organi sono fisicamente separati ma interconnessi dalla circolazione sistemica, permettendo interazioni multiple di organi. Il sistema IdMOC, sia con cellule o fette di tessuti provenienti da più organi, può essere utilizzato per valutare la tossicità di tipo cellulare-specifica o organo-specifica.