Probabilità e validazione

Recentemente si è discusso molto sul famoso dato del 33% (di cui parlavamo in questo articolo), addirittura qualcuno lo ha criticato, affermando che si trattasse di probabilità condizionata.
Secondo questi detrattori, infatti, il dato del 33% non conterebbe tutti i vari farmaci che l’animale ha scartato e che quindi non sono arrivati all’uomo.
Tuttavia, contando la minima traslazione, si può affermare con una certa sicurezza che le sostanze scartate dall’animale non saranno per forza nocive, anzi, non sapremo mai quanti e quali farmaci utili per curare patologie umane sono stati cestinati perchè sugli animali risultavano essere dannosi.
In ultima analisi, dunque, l’animale scarta sostanze, non sempre sostanze nocive (o almeno non si ha la certezza che lo siano), d’altra parte, poi, questi stessi dati (che i detrattori additano quale “probabilità condizionata”) sono quelli che vengono calcolati anche negli studi di validazione, pertanto i punti di riferimento per stabilire se i test su animali siano o meno “validi” devono per forza essere i minimi valori predittivi che consentano ad un metodo di non essere scartato.
Riportiamo qui uno scambio di mail tra un nostro sostenitore e il dott. Thomas Hartung, ex direttore dell’ECVAM, centro europeo per la validazione dei metodi alternativi, a cui è stato chiesto quali fossero i minimi valori di predittività sotto i quali un metodo viene scartato.
Ha risposto che in generale l’accuratezza che ci si aspetta debba essere al di sopra dell’80-90%, che il tasso di falsi positivi e di falsi negativi è anch’esso molto importante, così come l’affidabilità e la valutazione di quanto sia rilevante per gli esseri umani.
Conclude dicendo che quindi i dati che ci forniscono gli animali sono problematici.

Considerato tutto questo, i test su animali, qualora subissero un processo di validazione (retrospettiva), sarebbero subito scartati.

Critica ai modelli animali in psicologia e psichiatria

Critica ai modelli animali in psicologia e psichiatria

 

In ambito psicologico, l’uso degli animali è ampiamente criticabile, infatti il comportamento dell’animale è facilmente mal interpretabile: ad esempio uno stesso segnale può essere interpretato come questo o quell’altro sintomo a seconda della malattia mentale presa in esame.
Inoltre buona parte delle sue risposte provengono da influenze ambientali, che in uno studio sperimentale in laboratorio sono difficilmente riproducibili, creando reazioni spesso innaturali o non rappresentative di quelle che le creature avrebbero nel loro habitat d’origine.
A ciò si devono aggiungere i famosi “constraints of learning”, ovvero i limiti biologici dell’apprendimento: ad esempio un procione, spesso, negli esperimenti di condizionamento, può non riuscire più, dopo qualche prova, a mettere un gettone in una cassetta, proprio perché l’animale in natura manipola il cibo prima di mangiarlo: il gettone non viene più buttato via perché “è” il cibo e il cibo non va certo gettato.
Gli animali pertanto rispondono a situazioni simili in maniera dettata non solo dal contesto sperimentale, ma anche dai loro stessi metodi di nutrizione o più in generale di comportamento.
Se ciò non bastasse, un altro importantissimo aspetto della questione è il linguaggio, che da una parte permette un’interpretazione molto più complessa degli eventi esterni da parte dell’uomo (non a caso, nonostante abbiamo un numero simile a quello di altri primati di chunk, ovvero di unità d’informazione che riusciamo ad assimilare nella memoria a breve termine, le nostre possono includere più elementi in un insieme allargato e strutturato che verrà registrato come un singolo chunk) e dall’altra, in quanto specie-specifico, crea un forte ostacolo alla trasposizione delle risposte animali all’essere umano.
Infine, il comportamento psicologico degli esseri umani è il riflesso di fattori familiari, sociali e culturali che non sono riproducibili in esseri viventi non-umani.

Per quanto riguarda invece l’aspetto psichiatrico, nei modelli animali vengono spesso usate sostanze chimiche o lesioni per “riprodurre” la schizofrenia, ad esempio Schmajuk propone come modello per questa patologia una creatura con l’ippocampo lesionato [1], mentre Lillrank, Lipska e Weinberger crearono un danni eccitotossici nell’ippocampo di animali neonati per lo stesso scopo. [2]
I manuali diagnostici (tra cui il DSM-IV) stabiliscono invece che per porre diagnosi di schizofrenia occorre che il paziente non abbia assunto sostanze e che non vi siano condizioni mediche (come traumi cranici) in grado di giustificare la sintomatologia. [3]

Sempre nel DSM-IV è stabilito che per porre diagnosi di schizofrenia devono essere presenti almeno 2 dei seguenti sintomi: deliri, allucinazioni, eloquio disorganizzato, comportamento grossolanamente disorganizzato o catatonico, sintomi negativi (vale a dire appiattimento affettivo, alogia, abulia) e contemporaneamente deve verificarsi uno scadimento delle funzioni sociali/lavorative. [3]
La maggior parte dei sintomi qui presenti non sono riproducibili su animali (soprattutto per l’assenza del linguaggio), tranne pochi che sono comuni anche in molte altre situazioni (ad esempio l’appiattimento affettivo non è valutabile per quanto riguarda la parte idetica ma solo per quella comportamentale e può essere associato all’apatia, mentre il comportamento disorganizzato si riscontra anche in molte altre patologie come le demenze).

 

Spesso, per studiare la depressione, si somministra agli animali la reserpina, una sostanza in grado di produrre inibizione dell’attività motoria, perdita di peso, modificazione della condotta sessuale e alimentare e ipotermia. [4]
Nei disturbi affettivi coesistono più sintomi, di cui quelli idetici sono i più importanti e significativi per giungere ad una diagnosi corretta. I sintomi che ci fornisce l’animale, dunque, non possono essere un indice di depressione negli esseri umani, ma al massimo l’equivalente di alcuni aspetti comportamentali e organici della depressione.
E’ invece impossibile ricreare negli animali da laboratorio pensieri di morte, ridotta capacità di pensare e concentrarsi, sintomi di autosvalutazione o di colpa, tristezza, crisi di pianto, senso di vuoto, visione negativa del futuro, deliri di rovina e di negazione.

 

Per cercare di riprodurre un altro disturbo affettivo, la mania, si possono somministrare agli animali anfetamine [5], che producono stereotipia, ritiro sociale, aggressività, aumento dell’attività motoria e ipervigilanza.

Mancano, ovviamente, tutti i sintomi legati all’ideazione, che rappresentano invece la quasi totalità della sintomatologia umana (ovvero autostima ipertrofica o grandiosa, maggiore loquacità, fuga delle idee o pensieri che si succedono rapidamente, distraibilità, eccessivo coinvolgimento in attività ludiche potenzialmente dannose e deliri di onnipotenza).
Inoltre i disturbi maniacali sono ciclici e ricorrenti, invece quelli indotti su animali persistono finchè si somministrano le anfetamine.
Anche in questo caso per porre diagnosi di episodio maniacale bisogna escludere l’assunzione di sostanze psicoattive.
E’ interessante constatare come questi modelli sperimentali sono considerati validi sia per le ricerche sulla mania che per quelle sulla schizofrenia pur essendo due forme patologiche completamente diverse [5] [6].

 

La confusione, nei diversi ambiti, può arrivare ai limiti dell’assurdo: un animale che dopo essere stato sottoposto a shock elettrico ripetuto resta solo in un angolo della gabbia, può essere interpretato come un modello di ritiro sociale nella depressione (l’animale è depresso e quindi non vuole più socializzare), nella psicosi (l’animale non riesce a socializzare e quindi si manifesta un ritiro autistico) o nella nevrosi (l’animale evita l’ansia provocata dalla socializzazione). Ovviamente ciascun ricercatore interpreta il sintomo in base alla sua convenienza, ovvero alla patologia su cui sta compiendo ricerche.

Per quanto riguarda i disturbi dell’alimentazione, secondo il manuale DSM-IV [7], i criteri per l’anoressia nervosa (ma la cui valutazione vale anche per i criteri della bulimia nervosa) includono “un’intensa paura di acquistare peso o di diventare grassi, anche quando si è sottopeso”, “alterazione del modo in cui il soggetto vive il peso o la forma del corpo, o eccessiva influenza del peso e della forma del corpo sui livelli di autostima, o rifiuto di ammettere la gravità della attuale condizione di sottopeso” e “rifiuto di mantenere il peso corporeo al di sopra o al peso minimo normale per l’età e la statura”, tutti parametri che un modello animale non può soddisfare.

Nonostante questo, una procedura molto usata per “riprodurre” questi disturbi è quella di sottoporre gli animali a una falsa alimentazione (ad esempio si sutura un tubo di acciaio inossidabile nello stomaco di un animale, e dopo essere uscito dalla parete muscolare dello stomaco, il tubo fuoriesce dalla schiena, sotto la spalla della creatura. Questo tubo è connesso ad un ago che è cementato ad uno schermo di fibre di vetro. Il tubo con l’ago a sua volta è connesso ad un tubo di plastica che si estende attraverso un buco nel soffitto della gabbia dove si sta conducendo l’esperimento). [8]

 

Analisi critica dei modelli animali in psicofarmacologia

 

La Clorpromazina, un antipsicotico, sugli umani ha provocato diversi casi di tossicità epatica e a carico del sistema emopoietico, causando agranulocitosi. [9]

Questi gravi effetti collaterali non si erano verificati sul ratto [10] nè su altre specie usate nelle ricerche precliniche, tanto che si è giunti alla conclusione che non esista un modello animale per l’epatossicità della Clorpromazina. [11]

 

Gli antidepressivi non hanno ricevuto vantaggi dalle ricerche animali ed infatti Sitaram e Gershon affermano che “… quasi tutti i progressi significativi nel campo degli antidepressivi a partire dalla scoperta dell’Iproniazide e dell’Imipramina fino alla seconda generazione di antidepressivi introdotti di recente sono il risultato di acute osservazioni cliniche o scoperte casuali” [12].

 

La Zimelidina, un antidepressivo, era stata commercializzata all’inizio degli anni ’80, nel 1982 causò 7 decessi e 300 effetti collaterali di cui 60 gravi (convulsioni, danni epatici, febbre, emicranie, neuropatia, paralisi e 8 casi di Sindrome di Guillan-Barrè) che le causarono il ritiro l’anno successivo.
Andando a vedere la letteratura, nessun effetto tossico era stato evidenziato negli animali, nonostante le dosi maggiori [13].

 

La Mianserina, un altro antidepressivo, ha provocato in centinaia di pazienti gravi effetti collaterali a carico del sistema emopoietico che non erano stati dimostrati negli animali [14].
Successive ricerche condotte su tessuti umani hanno invece confermato quanto emerso a livello clinico. [15]

 

 

Note:

[1] Schmajuk NA. Animal models for schizophrenia: the hippocampally lesioned animal. Schizophr Bull. 1987;13(2):317-27.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3616522

[2] Lillrank SM, Lipska BK, Weinberger DR. Neurodevelopmental animal models of schizophrenia. Clin Neurosci. 1995;3(2):98-104.
ABSTRACT: http://www.n
cbi.nlm.nih.gov/pubmed/7583625

[3] American Psychiatric Association, Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th ed (DSM-IV), pp. 285–6.

 

[4] Leith NJ, Barrett RJ. Effects of chronic amphetamine or reserpine on self-stimulation responding: animal model of depression? Psychopharmacology (Berl). 1980;72(1):9-15.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6781010

 

[5] Varela RB, Valvassori SS, Lopes-Borges J, Fraga DB, Resende WR, Arent CO, Zugno AI, Quevedo J. Evaluation of acetylcholinesterase in an animal model of mania induced by d-amphetamine. Psychiatry Res. 2012 Dec 11. pii: S0165-1781(12)00771-8. doi: 10.1016/j.psychres.2012.11.021.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23245536

[6] Robinson TE, Becker JB. Enduring changes in brain and behavior produced by chronic amphetamine administration: a review and evaluation of animal models of amphetamine psychosis. Brain Res. 1986 Jun;396(2):157-98.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3527341

 

[7] DSM-IV. American Psychiatric Association. (1994). Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders (4th ed.). Washington, DC.

 

[8] Davis, John D.; Campbell, Constance S. Peripheral control of meal size in the rat: Effect of sham feeding on meal size and drinking rate. Journal of Comparative and Physiological Psychology, Vol 83(3), Jun 1973, 379-387.

ABSTRACT: http://psycnet.apa.org/index.cfm?fa=buy.optionToBuy&id=1974-00618-001

 

[9] Ben-Yehuda A, Bloom A, Lijovetzky G, Flusser D, Tur-Kaspa R. Chlorpromazine-induced liver and bone marrow granulomas associated with agranulocytosis. Israel Journal of Medical Sciences 1990, 26(8):449-451

ABSTRACT: http://europepmc.org/abstract/MED/2401609

 

[10] Castro-e-Silva Júnior O, Ceneviva R, Roselino JE. High chlorpromazine doses and liver function. Braz J Med Biol Res 1989; 22(3) :351-3.

ABSTRACT: http://www.unboundmedicine.com/anesthesia/ub/citation/2804470/High_chlorpromazine_doses_and_liver_function_

 

[11] “It has frequently been suggested that the jaundice which occurs in a small percentage of human patients following treatment with chlorpromazine is due to a hypersensitivity reaction. It has, however, proved impossible to obtain an animal model for this condition.”

Mullock BM, Hall DE, Shaw LJ, Hinton RH. Immune responses to chlorpromazine in rats. Detection and relation to hepatotoxicity. Biochem Pharmacol. 1983 Sep 15;32(18):2733-8.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6626244

 

[12] “Two major points emerge from our readings; the surprisingly poor track record of most if not all animal models to date (a) in accurately predicting clinically effective antidepressants and (b) in generating new and conceptually liberating hypotheses of the pathophysiology of depression. These observations are highlighted by the fact that almost every significant advance in antidepressant drug treatment from the discovery of iproniazid and imipramine to the recently introduced “second generation” class of antidepressants has resulted either from astute clinical observations or serendipity; a far cry from a planned, predictive, screening test. In fact many second generation antidepressants such as iprindol, mianserin, trazodone and salbutamol should be classified as “false negatives” on the conventional drug screening models (i.e., ineffective during preclinical screening but clinically efficacious). Conversely, a series of compounds, predicted to be at least as effective as imipramine, were reported to be clinically ineffective (i.e., false positives).”

Sitaram N, Gershon S. From animal models to clinical testing — promises and pitfalls. Prog Neuro-Psychopharmacol & Biol Psychiat 1983;7:227-228.

 

[13] Heel RC, Morley PA, Brogden RN, Carmine AA, Speight TM, Avery GS. Zimelidine: a review of its pharmacological properties and therapeutic efficacy in depressive illness. Drugs. 1982 Sep;24(3):169-206.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/6215240

 

[14] HM Clink. Mianserin and blood dyscrasias. British Journal of Clinical Pharmacology Volume 15, Issue S2, pages 291S–293S, April 1983
ABSTRACT: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2125.1983.tb05877.x/abstract
FULL TEXT: http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1365-2125.1983.tb05877.x/pdf

 

[15] Roberts P, Kitteringham NR, Park BK. Species differences in the activation of mianserin to a cytotoxic metabolite. Drug Metab Dispos. 1991 Jul-Aug;19(4):841-3.

Per ulteriori informazioni sull’argomento, consigliamo la lettura del libro “Sperimentazione Animale e Psiche: Un’Analisi Critica” di S. Cagno, Cosmopolis Edizioni.

Metodi in vitro: tessuti umani vs tessuti animali

I tessuti umani freschi sono considerati il modello più vicino per le funzioni umane in vivo e possono essere usati per misurare una vasta gamma di risposte farmacologiche:
“Fresh, functional human tissues have long been considered the closest possible model of human in vivo function and can be used to measure a wide range of pharmacological responses.”

Nonostante questo, i tessuti umani freschi vengono utilizzati molto raramente, per colpa di difficoltà logistiche ed etiche sulla disponibilità di tessuti e sulla praticità di lavori sperimentali:
“Despite this, relatively little drug development is conducted using fresh human tissue because of the logistical and ethical difficulties surrounding the availability of tissue and practicalities of experimental work. Most tests of drug activity require a living test system comprising cells, tissues or whole organisms”

Molte volte i tessuti umani freschi hanno il potenziale di ridurre o rimpiazzare i test su animali grazie a una superiore predizione dell’efficacia e della sicurezza dei farmaci:
“In some instances, “living” (fresh) human tissues have the potential to reduce or replace animal tests through superior prediction of drug safety and efficacy.“ [1]

Il fallimento della maggioranza dei farmaci nelle fasi cliniche dipende dalla mancata proprietà dei modelli animali di predire correttamente gli effetti che un farmaco può avere sugli esseri umani:
“However, as is clear from clinical trial failures during phases II and III, such in vivo models do not always predict the effects that a drug can elicit in humans”

I test con tessuti umani, che ovviamente sono considerati i MODELLI PIÙ VICINI ALLE FUNZIONI UMANE IN VIVO, possono colmare il divario che si ha tra i test su animali e le prove sui pazienti umani:
“Tests with human tissues, which are obviously considered to be the closest model of human in vivo function, could fill the gap between animal-based tests and trials in patients.”

Nonostante i chiari vantaggi, barriere logistiche ed etiche impediscono ai tessuti umani freschi di essere largamente usati durante lo sviluppo di farmaci: 
“Despite clear advantages, logistical and ethical barriers prevent fresh human tissues from being widely used during drug development.” [2]

Anche se i tessuti animali sono prontamente disponibili e sono relativamente economici, falliscono frequentemente nel predire i risultati che si osservano nelle fasi cliniche:
“Although animal tissues are readily available and are relatively inexpensive, they frequently fail to faithfully predict the results seen in the clinic.” 

I tessuti umani possono fornire risposte integrate per testare farmaci in una maniera più rappresentativa rispetto ai modelli di cellule individuali o alle sole linee cellulari, e sono più direttamente rilevanti per la specie di interesse – l’homo sapiens:  
“Human tissues can provide integrated responses to test drugs in a manner more representative than individual cell types or cell lines alone, and more-directly relevant to the species of interest — Homo sapiens.“

Per i test si possono usare tessuti che siano specifici del sito di attività del farmaco prendendoli da diverse locazioni nel corpo (e perciò tessuti di differenti ubicazioni possono variare tra loro). La scoperta di effetti avversi è fortemente aiutata dalla conoscenza su come si comportino i farmaci nel corpo umano. Questi farmaci possono agire come composti di riferimento, cosicché nuovi composti possano essere comparati, usando studi su modelli standard di concentrazione-risposta, in un’enorme varietà di tessuti, e i loro effetti possono essere estrapolati da ciò che si conosce dei composti di riferimento:
“Moreover, where there is the potential to obtain tissue from various locations, it becomes possible to test tissue that is specific to the site of drug activity. This is important, as differences may occur between the same tissue types in different locations in the body. The detection of adverse effects is greatly helped by knowledge of how existing drugs behave in the human body. These drugs can act as reference compounds, so that new compounds can then be compared, by using standard concentration-response type studies, in a huge variety of tissues, and their effects extrapolated from what is known of the reference compounds.” [3]

Saggi funzionali di tessuti umani possono essere usati per misurare una vasta gamma di effetti fisiologici a livello dell’organo, della cellula o addirittura del gene. In relazione alla scoperta di farmaci, questi saggi sono stati usati in tre aree principali: scoperte in biologia, efficacia farmacologica in vitro e sicurezza farmacologica: 
“Functional human tissue assays can be used to measure a vast range of physiological effects at the level of the organ, cell or even gene. In relation to drug discovery, such assays have been used in three main areas: discovery biology, in vitro efficacy pharmacology, and safety pharmacology.”

L’area più comune in cui questi saggi sono stati applicati è stata quella delle scoperte biologiche, investigare i meccanismi sottostanti il target di un nuovo farmaco o confermare che un target identificato in un particolare tessuto sia capace di provocare una risposta fisiologica:
“The most common area to which assays have been applied has been discovery biology, to investigate the mechanisms underlying a novel drug target or to validate that a target identified in a particular tissue is capable of eliciting a physiological response.”

Inoltre, i saggi di tessuti umani sono considerati un’importante aggiunta alle routine di sicurezza ed efficacia dei test farmacologici:
“Furthermore, as the available assays develop, they are considered an important adjunct to routine safety and efficacy pharmacology tests.” 

I TESSUTI UMANI SPESSO SONO MIGLIORI DEGLI ANIMALI NELL’ESTRAPOLAZIONE DEI DATI ALL’UOMO:
“Such approaches are often superior to extrapolation from animal data.” [4]

Il problema quindi non è scientifico, non è stabilire se l’uso di tessuti umani sia valido o meno, ma è organizzativo: è difficile procurarseli.
Società come la Biopta e la Asterand stanno lavorando per abbassare le barriere che circondano la disponibilità dei tessuti e la praticità dei lavori sperimentali.
In Italia, I-CARE supporta in ogni modo possibile l’utilizzo di questi tessuti e di colture cellulari senza siero animale.

Note:
[1] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Cell Tissue Bank. 2011 Feb;12(1):31-2. doi: 10.1007/s10561-010-9213-5. Epub 2010 Sep 8.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20824349

[2] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Altern Lab Anim. 2010 Dec;38 Suppl 1:27-30.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21275480

[3] Hillier C, Bunton D. Could fresh human tissues play a key role in drug development? Altern Lab Anim. 2009 Sep;37 Suppl 1:5-10.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19807198

[4] Hillier C, Bunton D. Functional human tissue assays. Drug Discov Today. 2007 May;12(9-10):382-8. Epub 2007 Apr 5. 
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17467574

I modelli animali sono buoni come pensiamo? NO.

Sebbene questo studio non sia totalmente antivivisezionista, dà comunque molti spunti utili sull’opposizione scientifica alla sperimentazione animale:

Troppe volte, i risultati estrapolati da studi usando decine di milioni di animali falliscono accuratamente nel predire le risposta umane. Le inadeguatezze nei disegni sperimentali possono giustificare alcuni dei fallimenti.
Tuttavia, recenti scoperte di inaspettate variazioni nell’organizzazione e nella regolazione del genoma possono rivelare una finora sconosciuta carenza di omologia tra i modelli animali e gli obiettivi degli animali che potrebbero giustificare una significativa proporzione della debolezza nell’abilità predittiva:

“On average, the extrapolated results from studies using tens of millions of animals fail to accurately predict human responses. Inadequacies in experimental designs may account for some of the failure. However, recent discoveries of unexpected variation in genome organization and regulation may reveal a heretofore unknown lack of homology between model animals and target animals that could account for a significant proportion of the weakness in predictive ability.”

I rapporti evolutivi spesso non sono un buon criterio per la selezione di un modello:
“evolutionary relatedness may not always be a good criteria for model selection”

Non è raro per i risultati di esperimenti comparativi su animali rivelino differenze biologiche che invalidano l’uso delle specie in questione come modelli per un’altra specie:
“It is not uncommon for comparative animal experimental results to be informative in revealing biological differences that argue against using the species under investigation as models for one another.”

Rivela poi alcuni esempi di fallimento del modello animale:
“Unfortunately, animal models often do not faithfully resemble the corresponding human disease. For example, one of the first surprises following the establishment of gene targeting was the lack of the typical Lesch-Nyhan phenotype in a mutant mouse deficient in hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT). This disconcordance turned out to be due to alternative and redundant metabolic pathways utilized by mice and man. Similarly, mice deficient in the CFTR gene did not exhibit the pulmonary effects of cystic fibrosis but instead suffered from severe gastrointestinal obstruction.”

Uno studio recente dimostra che anche la regolazione tessuto-specifica diverge significativamente tra l’uomo e il topo:
“This unpredicted observation is probably explained by a recent study which demonstrated even tissue-specific regulation has diverged significantly between human and mouse”

Recentemente, pochi minuti dopo l’iniezione di un farmaco anti-infiammatorio, il TGN1412, sei volontari hanno sofferto di insufficienza multiorgano. Il TGN1412 è stato testato ampiamente su conigli e scimmie senza che venisse riportato alcun serio effetto collaterale:
“Recently, just minutes after injection of an anti-inflammatory drug, TGN1412, six volunteers suffered multiple organ failure. TGN1412 had been tested extensively in rabbits and monkeys with no serious side effects reported.”

Una recente pubblicazione dell’FDA indica che il tasso di successo di un nuovo composto medico che entra in fase clinica 1 per arrivare in commercio non è maggiore dell’8%.
Modelli animali inadeguati sono molto probabilmente il maggior ostacolo nella scoperta e nello sviluppo di farmaci:
“A recent publication by the FDA indicates that the rate of success for a new medical compound entering Phase 1 clinical testing to reach the market is not greater than 8%. Inadequate animal models are most likely one of the major hurdles in drug discovery and development.” 

Il modello animale dà molti risultati falsi positivi e molti falsi negativi:
“It is interesting to speculate that animal models maybe just as likely to exhibit false positive results (compound or devise would be OK in humans but show adverse effects in animal
studies) as they do false negatives results (OK in animal studies but have adverse outcomes in human trials).”

[Wall RJ, Shani M. Are animal models as good as we think? Theriogenology. 2008 Jan 1;69(1):2-9. Epub 2007 Nov 7.]

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17988725

FULL TEXT: http://naldc.nal.usda.gov/download/13645/PDF

“Philosophy, Ethics and Humanity in medicine”: rivista peer-reviewed

“Philosophy, Ethics and Humanity in medicine” è una rivista peer-reviewed, che tratta argomenti molto vari che spaziano dalla filosofia della scienza alla medicina, alla biologia, alla bioetica, ecc…
Prima di venir eventualmente accettati per la pubblicazione, gli articoli vengono sottoposti a revisione paritaria (peer review) da parte di esperti sia in campo epistemologico che nel settore bio-medico.
[http://www.peh-med.com/about#publication]

Ha pubblicato, contro la sperimentazione animale: 

http://www.peh-med.com/content/4/1/2
[Shanks N, Greek R, Greek J. Are animal models predictive for humans?
Philos Ethics Humanit Med. 2009 Jan 15;4:2.]

e

http://www.peh-med.com/content/5/1/14

[Greek R, Greek J. Is the use of sentient animals in basic research justifiable? Philos Ethics Humanit Med. 2010 Sep 8;5:14.]

che minano il pregiudizio di utilità del modello animale, rispettivamente, come modello CAM e nella ricerca di base.

Malattie neurodegenerative: il topo è INUTILE

MODELLO MURINO: “USELESS” (INUTILE)

In questo articolo il modello murino è definito “inutile” nella cura delle malattie neurodegenerative.

“”Penso che ci sia un senso di disperazione nel fatto che ci serva un modello utile per portare farmaci alle prove cliniche” […] Ma la disperazione, aggiunge, è una giustificazione inadeguata per continuare ad usare un modello mediocre.”

 “I think there’s a sense of desperation that we need a convenient model for bringing drugs to clinical trial,” says Benatar. “And I do sort of hear that concern.” But desperation, he adds, is an inadequate justification for the continued use of a poor model. “It’s a bit like the proverbial drunk who keeps looking for his lost keys under the lamp post, simply because the light’s better there.”

 “The results of drug tests in mice have never translated perfectly to tests in humans. But in recent years, and especially for neurodegenerative diseases, mouse model results have seemed nearly useless. In the past year, for example, three major Alzheimer’s drug candidates, Alzhemed (3-amino-1-propanesulphonic acid), Flurizan (tarenflurbil) and bapineuzumab, all of which had seemed powerfully effective in mouse models, have performed weakly or not at all in clinical trials involving thousands of human Alzheimer’s patients.”

“In the case of ALS, close to a dozen different drugs have been reported to prolong lifespan in the SOD1 mouse, yet have subsequently failed to show benefit in ALS patients.”

“Alzheimer’s mouse models typically develop amyloid ‘plaques’ in their brains, but they do not develop an Alzheimer’s-like dementia and anti-amyloid strategies have repeatedly failed to slow the disease in clinical trials. Parkinson’s researchers have never had a good mouse model for the full disease process, and even the mouse model for Huntington’s disease — a relatively simple genetic disease — does not fully reproduce the clinical signs seen in humans with the disorder.”

http://www.nature.com/news/2008/080807/full/454682a.html

[Schnabel J. Neuroscience: Standard model. Nature. 2008 Aug 7;454(7205):682-5. doi: 10.1038/454682a.]

Diabete e animali: differenze di specie

Gli autori dell’articolo hanno scoperto e dimostrato che la struttura del tessuto umano responsabile della produzione di insulina è fortemente diversa da quello dei roditori, animali normalmente utilizzati per studi sul diabete.

Per piu’ di 30 anni è stato commesso il solito errore metodologico: assumere che le cellule, i tessuti e le reazioni biochimiche dei roditori fossero simili e/o confrontabili con quelle umane.

Gli autori della ricerca concludono che non bisogna continuare a utilizzare animali per questo tipo di studi in quanto falserebbero per la ricerca scientifica.
Semplificando l’aspetto tecnico del discorso, si possono spiegare le differenze fondamentali tra i tessuti pancreatici che regolano il livello di glucosio nel sangue, dicendo che ci sono 4 tipi di cellule coinvolte: cellule alfa (glucagone), beta (insulina), delta (somatostatina) e PP (polipeptidi pancreatici).

Nei roditori il tessuto è formato da un nucleo di cellule beta circondate in vario modo dalle altre cellule mentre negli uomini tutte le 4 tipologie di cellule sono mescolate insieme con un contatto intercellulare molto maggiore.

Nei roditori le cellule beta sono il 77% delle cellule mentre nell’uomo solo il 55%.

Il 71% delle cellule beta nei roditori sono “legate” a cellule beta confinanti mentre nell’uomo, dove le cellule sono molto piu’ mescolate, solo il 29% lo sono.

A seguito di questo studio è stato quindi possibile, con un ritardo di decenni, capire meglio il funzionamento dei tessuti, le modalità di produzione dell’insulina e le risposte cellulari ai diversi livelli di glucosio.

“Because we used the same approach to quantify the different cell types in both mouse and human islets, we conclude that our results reflect major differences in the cell composition between the two species”

“Human, monkey, and mouse islets showed functional differences that correlated with structural differences.”

“Species differences in islet cell composition have functional consequences, as suggested by our results showing that human and monkey islets, but not mouse islets, respond with [Ca2+]i increases to low glucose concentrations.”

FULL TEXT: http://www.pnas.org/content/103/7/2334.full.pdf

The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for islet cell function (2334-2339, Proceedings of the National Academy of Science, 14 Febbraio 2006, vol. 103, no. 7).

Uno degli autori, il prof. Per-Olof Berggren, professore presso il Diabetes Research Institute di Miami e presso il Rolf Luft Center for Diabetes Research di Stoccolma, dichiara esplicitamente: “La nostra maggiore scoperta è che il tessuto pancreatico umano ha una struttura totalmente unica e ha una modalità di funzionamento diversa rispetto a quello dei roditori. Non possiamo piu’ continuare a basarci su studi condotti su topi e ratti. E’ imperativo ora focalizzarci sui tessuti umani perché, alla fine, è l’unico modo che abbiamo per capire come funzionano.”

“Our major finding is that human pancreatic islets have a unique architecture, and work differently than rodent islets,” said Per-Olof Berggren, adjunct professor at the Diabetes Research Institute and professor at the Rolf Luft Center for Diabetes Research at Karolinska Institutet in Stockholm, Sweden. “We can no longer rely on studies in mice and rats. It is now imperative that we focus on human islets. At the end of the day, it is the only way to understand how they function.”

Il dr. Camillo Ricordi, chirurgo, direttore scientifico del Diabetes Research Institute, pur non essendo completamente antivivisezionista, sostiene che “Bisogna sottolineare l’importanza della difficoltà di estrapolazione dei risultati nel passare dai roditori all’uomo. Usando tessuti umani e sistemi modello possiamo trasferire nuove scoperte in trattamenti innovativi per pazienti in un modo piu’ veloce, efficiente e sicuro.”

“However, it does underscore the critical importance of translational research, that is, to determine if observations obtained in rodent studies are relevant to patients. Using human tissues and pre-clinical model systems, we can transfer any new pertinent finding toward new treatments for patients in the fastest, most efficient and safest way possible.”

[http://www.diabetesresearch.org/page.aspx?pid=409]

Vivisezione o Metodi Scientifici: dalla parte di Equivita

Recentemente, il gruppo pro-SA “In Difesa della Sperimentazione Animale”, ha commentato l’articolo “Vivisezione o Metodi Scientifici: una Scelta” del Dottor Stefano Cagno.
Analizziamo i loro errori, nella critica al testo:
Dicono:
“Se esiste un metodo che sostituisce in tutto e per tutto l’animale in un esperimento è obbligo di legge utilizzarlo e quindi già non si usa l’animale e il problema Non si pone nei termini in cui suggerisce l’articolo di Equivita, cioè che i metodi ci sono ma non si utilizzano. Gli esperimenti su animale, infatti, devono essere autorizzati e se esiste un metodo alternativo deve essere utilizzato.”
Tuttavia, i metodi alternativi a cui fanno riferimento i pro-sperimentazione animale (da ora in avanti abbreviati in pro-sa), sono quelli validati usando come modello di riferimento l’animale.
In questo senso, criticando il modello animale quale gold standard, bisogna per forza di cose criticare un metodo di validazione che si basa su di esso.
Non a caso, nella sostituzione del Draize Test, c’è stata necessità di rieffettuare una validazione, non per colpa dei metodi sostitutivi, ma per i falsi positivi che il Draize test tendeva a dare [1]
A questo punto, i pro-sa affermano:
“La sperimentazione tossicologica in vivo (la sperimentazione animale) non ha bisogno di validazione perché è la prima metodica che è stata inventata”
Al che, rispondiamo con il testo di una pubblicazione [2]:
“L’affermazione che i test su animali siano intrinsecamente validi, solo perché sono test su animali, è discussa e respinta. Si è concluso che non c’è alcuna ragione giustificabile per sottoporre i test su animali a procedure nuove o considerevolmente modificate che siano meno rigorose di quelle applicate ai test senza animali e alle strategie di sperimentazione”
Altra assunzione è la seguente:
“la sua efficacia è riscontrabile nel numero di tossicità gravi che si verificano nelle fasi cliniche dei farmaci. Numeri alla mano, i casi di molecole molto tossiche che sono state riscontrate come tali in fase clinica sono obiettivamente molto molto poche…”
Dimenticano, ovviamente, che i livelli posologici da cui si iniziano i test nell’uomo sono di solito 1/100 della dose NOAEL (NO Adverse Affect Level), cioè della dose più bassa alla quale, nell’animale, non si sono verificati effetti collaterali di sorta (ovviamente partire da una dose che sia più bassa di quella animale è già una conferma di per sé della mancanza di attendibilità del modello animale).
Contando dunque che le morti per effetti avversi sono più di 100.000 all’anno nei soli Stati Uniti [3], l’effetto devastante della sperimentazione animale è sotto gli occhi di tutti, se poi pensiamo che il 92% di queste vengono scartate nelle fasi sull’uomo [4], se non si applicasse questa prudenza (che, ribadiamo, conferma già di per sé la mancanza di attendibilità del modello animale), tali effetti sarebbero probabilmente notabili già nelle prime fasi cliniche.
Si dice:
“La “validazione” che il Dr. Cagno vorrebbe fosse fatta, consisterebbe nel prendere una serie di sostanze molto tossiche nell’animale (e che quindi non non sono state testate nell’uomo) e fare quello che servirebbe per validarle, cioè testarle nell’uomo.”
Ma non corrisponde al vero, infatti le revisioni sistematiche potrebbero benissimo rappresentare una vera e propria procedura di validazione, dato che le validazioni retrospettive sono anche ufficialmente adottate dall’ECVAM per i metodi in vitro o in silico ai fini regolatori [5]. Questi studi retrospettivi, infatti, ci informano sull’utilità clinica degli animali nella ricerca scientifica, confrontando i dati derivanti da varie specie animali con quelli ottenuti sull’uomo e indagando sulla ripetibilità e riproducibilità dei test su animali. In questo modo possiamo ottenere i valori di sensibilità, specificità, predittivi e i rapporti di verosimiglianza, che nel complesso ci permettono di valutare la rilevanza di un determinato metodo.
Affermano addirittura che non sia vero che si sovvenzionino maggiormente gli esperimenti animali rispetto a quelli sostitutivi, perché “il CAAT e l’ECVAM, ed altri istituti simili che sono lautamente finanziati”, c’è da chiedersi come mai però, abbia potuto citare solo questi due istituti, mentre di corrispettivi per la sperimentazione animale ve ne sono un’infinità.
Continuano dicendo che i test in vitro sono “comunemente utilizzati in tossicologia e in numerosi altri ambiti di ricerca, ma Non sono sostitutivi dell’animale, ma complementari.”
Tuttavia la stragrande maggioranza delle cellule in vitro utilizzate sono cellule animali, che dunque avranno una scarsa attendibilità al pari degli organismi interi non-umani.
Affermano dunque:
“Cosa vorrebbe dire testare un farmaco tramite metodi epidemiologici? Vorrebbe dire metterlo in commercio e valutare a posteriori i problemi.”
Senza rendersi conto che non si parlava di farmaci nella spiegazione del dottore, che invece parlava di fattori di rischio già noti che invece si sono spesso ignorati in attesa che il modello animale li confermasse: “L’impiego della epidemiologia e della statistica ha permesso di riconoscere la maggior parte dei fattori di rischio delle malattie cardiocircolatorie quali l’ipertensione arteriosa, il fumo di sigaretta, il soprappeso, l’ipercolesterolemia, la mancanza di esercizio fisico. Queste ricerche mettono di solito a confronto due condizioni, ad esempio il fumo di sigarette e lo sviluppo di tumori polmonari. In questo caso si è dimostrato che aumentando il numero delle sigarette fumate, aumenta anche il rischio di sviluppare un tumore polmonare e quindi, di conseguenza, che il fumo di sigaretta è cancerogeno.”
Citano dunque il Talidomide, con la seguente affermazione:
“non furono eseguiti i test di teratogenesi su animale gravido (all’epoca non erano obbligatori) e il risultato è stato di circa 10.000 bambini malformati.”
Tuttavia, nel ricreare le malformazioni che si sono verificate nell’uomo, usando topi, ratti e criceti si verificavano raramente e solo a dosi DA 30 A 500 VOLTE MAGGIORI RISPETTO ALLA DOSE TERATOGENA NELL’UOMO, e solo in alcune situazioni, tra cui l’induzione di carenze alimentari, deplezione di glutatione assieme alla somministrazione giornaliera per tutto l’arco della gravidanza e nel periodo pre-concepimento, somministrazione endovenosa… [6]
Si continuano a citare isolatamente i vari metodi alternativi e le loro limitazioni, scordando due cose:
1) Che bisognerebbe prima di tutto dimostrare l’attendibilità della S.A., quando addirittura Donald Prater, dell’FDA, ente statunitense che si occupa dell’immissione dei farmaci, afferma “E’ chiaro che gli studi su animali in vivo possono non essere il gold standard”[7] e, come già detto prima, le revisioni sistematiche non ce l’hanno ancora confermato (anzi, vanno in tutt’altra direzione).
2) Che i metodi alternativi vanno utilizzati insieme, Thomas Hartung ad esempio afferma che nella sostituzione degli animali bisogna applicare una strategia integrata, unendo vari test sostitutivi tra loro [8]. Da questo punto di vista, è preferibile un insieme di dati attendibili, che si completano a vicenda, piuttosto che i risultati di un organismo intero che però è diverso da noi e della cui predittività possiamo enormemente dubitare.

Note:
[1] “we now understand why the alternatives failed: their results were being compared with those of the Draize test itself, which, it turns out, yields many false positives.”
Alan M. Goldberg, Thomas Hartung, “Protecting more than animals”, Scient
ific American, January 2006
[2] “The proposition that animal tests are inherently valid, merely because they are animal tests, is discussed and is rejected. It is concluded that there is no justifiable reason for subjecting new or substantially modified animal test procedures or testing strategies to a validation process that is any less stringent than that applied to non-animal tests and testing strategies”
Balls, M. (2004) Are animal tests inherently valid? ATLA: Alternatives to Laboratory Animals, 32(Suppl. 1B), 755–758.
[3] “Each year prescription drugs injure 1,5 million people so severely they require hospitalization and 100 000 die, making prescription drugs a leading cause of death in the United States”
Moore T.J., Psaty BM. e Furberg CD. Time to act on drug safety. JAMA, 279: 1571-1573, 1998
[4] Anne Harding. More Compounds Failing Phase I. The Scientist September 13, 2004
[5] Worth A, Zuang V. A modular approach to the ECVAM principles on test validity. Altern Lab Anim. 2004 Nov;32(5):467-72.
Worth, A.P. & Balls, M. (2002). The principles of validation and the ECVAM validation process. ATLA 30, Suppl. 2, 15–21.
[6] Klein Obbink H J, Dalderup L M Effects of Thalidomide in the Rat Foetus. Experientia XIX/12: 645-646(1963)
Wells PG, Bhuller Y, Chen CS, Jeng W, Kasapinovic S, Kennedy JC, Kim PM, Laposa RR, McCallum GP, Nicol CJ, Parman T, Wiley MJ, Wong AW. Molecular and biochemical mechanisms in teratogenesis involving reactive oxygen species. Toxicol Appl Pharmacol. 2005 Sep 1;207(2 Suppl):354-66.
Parkhie M, Webb M. Embryotoxicity and teratogenicity of thalidomide in rats.Teratology. 1983 Jun;27(3):327-32.
Meganathan K., S. Jagatp, Vilas Wagh, JA Gaspar, J Winkler, J Hescheler, A. Sachinidis, Embryonic stem cells differentiation substantiates thalidomide teratogenicity Toxicology LettersVolume 211, Supplement, 17 June 2012
Fratta Sigg Maiorana ,Teratogenic effects of thalidomide in rabbits, rats, hamsters, and mice, Toxicology and Applied Pharmacology Volume 7, Issue 2, March 1965, pp. 268–286
Runner MN. Comparative pharmacology in relation to teratogenesis. Fed Proc. 1967 Jul-Aug;26(4):1131-6.
(di cui qui una tabella con le dosi usate nelle varie specie durante gli studi di teratogenesi effettuati successivamente all’accaduto, ripresa da Schardein J: Drugs as Teratogens CRC Press; 1976.:
http://sperimentazioneanimale.files.wordpress.com/2012/09/scherdein-table.jpg )
[7] “It is clear that in vivo animal studies may not be the gold standard”
http://us4.campaign-archive2.com/?u=066d5d7abe2de2d5e04d214bf&id=6435b91567
[8] “Second, we must not rely on one tool only: the combination of tools with complementary strengths, such as a sensitive and a specific test, can overcome weaknesses. Integrated testing, especially using different technologies, is most promising.”
Hartung T. Food for thought… on animal tests. ALTEX. 2008;25(1):3-16.

EVOLUZIONE COME DIFFERENZA INTERSPECIFICA

Questo studio, sebbene non sia completamente antivivisezionista, spiega il ruolo dell’evoluzione nella differenza delle funzioni delle proteine nelle varie specie e invita alla cautela nell’uso del modello animale, con particolare riferimento ai modelli transgenici:
“Changes in essentiality between species were associated with adaptive evolution of the proteins, consistent with previous findings that changes in protein function are often associated with rapid evolution. By examining the evolution of genes that have changed essentiality between humans and mice in a broader context, they found that positive selection was much more common in the human lineage than in the rodent, suggesting that the differences in essentiality arose during human evolution”

“the assumption that gene functions and genetic systems are conserved between models and humans is taken for granted, often in spite of evidence that gene functions and networks diverge during evolution. In this review, I discuss some mechanisms that generate functional divergence and highlight recent examples demonstrating that gene functions and regulatory networks diverge through time.”

“Therefore, animal models of gene function and human disease may not provide appropriate information, particularly for rapidly evolving genes and systems.”

“Annotation of gene functions based solely on mutant phenotypes in animal models, as well as assumptions of conserved functions between species, may be misleading. Perhaps more importantly, animal models of human disease may not provide appropriate information on gene function, particularly for rapidly evolving genes and systems.”

“It is vitally important to demonstrate equivalence between the model and human gene with respect to the particular function under study to avoid spurious conclusions.”

Vincent J. Lynch
Use with caution: Developmental systems divergence and potential pitfalls of animal models
Yale J Biol Med. 2009 June; 82(2): 53–66.

FULL TEXT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2701150/

 

DIFETTI DI VALIDAZIONE E STUDI RETROSPETTIVI

IL PRIMO METODO ALTERNATIVO VALIDATO DA UN’EVIDENZA RETROSPETTIVA NEL RIMPIAZZO DEL DRAIZE TEST

Il Cytosensor Microphysiometer doveva rimpiazzare il Draize Test, ma il risultato fu inizialmente inconcludente, dato che si confrontò il suo risultato con quello del Draize test stesso, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive.

The results for CM were inconclusive as were those from other tests evaluated as stand-alone methods to fully replace the animal test. In 2002, the European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) started applying concepts from evidence-based medicine, and opened validation to retrospective meta-analysis. This activity was done in collaboration with US counterpart ICCVAM/NICEATM, and the European Cosmetics Association, Colipa. After a new, comprehensive evaluation of the prior available data, the ECVAM scientific advisory committee (ESAC) has recently accepted the CM as capable of identifying non-irritants for testing limited to water-soluble surfactants and water-soluble surfactant-containing mixtures.

Hartung T, Bruner L, Curren R, Eskes C, Goldberg A, McNamee P, Scott L, Zuang V.
First alternative method validated by a retrospective weight-of-evidence approach to replace the Draize eye test for the identification of non-irritant substances for a defined applicability domain.
ALTEX. 2010;27(1):43-51.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20390238