Archivi del mese: gennaio 2013

Neuroscienze e modello animale

Le comparazioni tra il cervello umano e quello dei primati non-umani sono limitate dalla maggior complessità del primo, a causa della sua più grande dimensione e della sua capacità di linguaggio.

Nonostante vi siano controparti delle strutture del cervello (ad esempio) del macaco in quello umano, le loro funzioni possono aver deviato durante il corso dell’evoluzione. Spesso, aree nel cervello che sembrano avere determinate funzioni nelle scimmie non hanno lo stesso ruolo nell’essere umano.

Per quanto riguarda gli ampi dettagli strutturali dei cervelli umani e dei primati, Hacia scrive:

“I cerebrotipi, una misura da specie a specie della dimensione e nell’architettura del cervello, sono stati esaminati nei lignaggi di primati. Benchè soggetto ad interpretazione, il cervelletto fu trovato ad occupare una costante frazione del volume totale del cervello in un diverso numero di mammiferi. Nei primati il telencefalo è cresciuto considerevolmente alle spese di midollo, mesencefalo e diencefalo. Questa tendenza è più pronunciata negli umani e in altri ominidi rispetto ai primati inferiori. Il componente della neocorteccia del telencefalo mostra la sua più grande espansione negli ominidi laddove ippocampo, setto, schizocorteccia, corteccia piriforme e bulbo olfattivo diminuivano. Relativamente agli altri primati, gli umani mostrano un’aumentata connettività interemisferica nella materia cerebrale bianca, ma una minore connettività interemisferica nel corpo calloso e nella commessura anteriore. Questa sembra essere una funzione della dimensione del cervello. Gli umani hanno dimensioni cerebrali più ampie (~1300 cm³) rispetto ad altri primati come i comuni scimpanzè (~340 cm³), i gorilla (~380 cm³) e le scimmie rhesus (~80 cm³).

Sembra accettabile che la relativa abbondanza di tipi cellulari specifici sarà altresì importante nell’evoluzione del cervello dei primati. I neuroni piramidali e non piramidali, che compongono la neocorteccia, sono conservati in diversi lignaggi di primati. Tuttavia, i neuroni di Von Economo sono presenti in umani, scimpanzè, gorilla e orangutan ma non in altri primati.

Questi neuroni sono più abbondanti negli scimpanzè e negli umani. E’ interessante notare che gli umani tendono ad avere più neuroni di Von Economo con dimensioni cellulari maggiori rispetto agli scimpanzè. La loro localizzazione nella corteccia cingolata anteriore li implica in comunicazione, comprensione del linguaggio e funzioni automatiche. Specifici neuroni in molteplici individui in diversi stadi dello sviluppo necessitano di essere meticolosamente esaminati per indirizzare rigorosamente l’evoluzione cerebrale. Tuttavia, questioni di maggior etica, legali e sociali riguardanti l’approvvigionamento di esemplari sono presumibilmente in grado di impedire questo tipo di esperimenti negli umani e nelle scimmie antropomorfe”. [1]

Vi sono differenze nella fisiologia e anatomia di base tra gli umani e gli scimpanzè. Enard et al [2] hanno comparato il trascrittoma nei leucociti del sangue, nel fegato e nel cervello di umani, scimpanzè, orangutan e macachi usando microarray, così come l’espressione di proteine negli umani e negli scimpanzè. Hanno anche studiato tre specie di topo che sono approssimativamente correlate tra loro come lo sono umani, scimpanzè e orangutan. Hanno identificato profili specie-specifici di espressione genica indicando come cambi nell’espressione genica e di proteine siano stati particolarmente pronunciati nel cervello umano. Hanno comparato i livelli di mRNA nel cervello e nel fegato di umani, scimpanzè e di un orangutan.

Hanno esaminato approssimativamente 12 000 geni umani (guarda la tabella e le figure sottostanti):

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Tabella 1. Le differenze nel profilo di proteine cerebrali tra gli umani e gli scimpanzè come analizzato dal gel 2D elettroforesi. Le differenze tra umani e scimpanzè sono state segnate se confermate in tre coppie individuali di umani-scimpanzè e sono state analizzate nello stesso modo del più ampio studio sui topi in cui venivano comparati M. musculus ed M. spretus. Le differenze qualitative rappresentano cambi nella mobilità elettroforetica degli spot, che presumibilmente risultano da sostituzioni amminoacidiche, considerato che le differenze quantitative riflettono cambiamenti nell’ammontare di proteine.

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Figura 1. Distanze sotto forma di alberi rappresentanti la relativa estensione di cambi di espressione nel cervello e nel fegato tra (A) tre specie di primati e (B) tre specie di topi: MUS., M. musculus; SPR., M. spretus; e CAR, M. caroli (6). I numeri si riferiscono alla proporzione tra i cambiamenti comuni a umani e scimpanzè e quelli di M. musculus e M. spretus, rispettivamente. 

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Figura 2.  Distanze sotto forma di alberi rappresentanti la relativa estensione dei cambiamenti di espressione tra 3 specie di primati e 3 tessuti così come sono risultati dai saggi di cDNA. I numeri si riferiscono alla proporzione tra i cambiamenti comuni a umani e scimpanzè. 

Enard et al dichiara:
“I nostri risultati mostrano che quel grande numero di cambiamenti quantitativi nell’espressione genica può essere rilevato tra mammiferi vicini e imparentati tra loro. In aggiunta suggeriscono che questi cambiamenti sono stati particolarmente pronunciati durante la recente evoluzione del cervello umano. Le ragioni sottostanti a queste differenze nell’espressione sono presumibilmente molteplici, ad esempio, duplicazione e delezione di geni, cambiamenti nei promotori, cambiamenti nei livelli di fattori di trascrizione e cambiamenti nell composizione cellulare di tessuti.”

I modelli di malattie umane sono generalmente sviluppati in primati non umani in quanto sono soggetti con caratteristiche comportamentali e anatomiche simili a quelle umane. Ma le differenze specifiche giocano un ruolo nell’espressione clinica così come nella specificità cellulare della malattia. Ad esempio, la degenerazione striatale negli umani è frequentemente associata con la dischinesia, mentre nei primati nonumani, le lesioni eccitotossiche da sole non sono sufficienti a indurre dischinesia o corea. Secondo, in aggiunta a queste differenze tra specie, il tempo dell’evoluzione dell’andamento della degenerazione delle cellule nervose, che normalmente si evolve in diversi anni nelle malattie neurodegenerative negli umani, mentre, per ragioni pratiche, è sostituito da un più breve periodo nei modelli animali.

Come scrivono i ricercatori al Salk Institute e all’Università della California:

“Cosa si conosce della neuroanatomia del cervello umano? Abbiamo una mappa corticale umana corrispondente a quella per il macaco? E a cosa assomiglia l’equivalente umano della mappa associativa? La vergognosa risposta è che non abbiamo queste dettagliate mappe perchè, per ovvie ragioni, la maggior parte dei metodi sperimentali usati sul cervello dei macachi non può essere usata su umani […] Per altre regioni corticali, come le aree del linguaggio, non possiamo usare il cervello del macaco neanche come guida abbozzata in quanto probabilmente mancano regioni comparabili” [3]

I cervelli dei primati non-umani e umani sono innegabilmente simili nella struttura, ma ciò non implica che le strutture nel cervello dello scimpanzè
abbiano le stesse funzioni di simili strutture nel cervello umano. Il cervello dello scimpanzè non è una versione più piccola e più primitiva del cervello umano, è un sistema complesso con la sua unica storia evolutiva. Ci saranno differenti sviluppi di moduli negli umani e negli scimpanzè che riflettono che le due specie hanno preso distinte traiettorie evolutive, adattando e risolvendo differenti problemi cognitivi nel corso dell’evoluzione. Le somiglianze strutturali nel sistema visivo dei primati, ad esempio, ci dicono molto poco sul carattere soggettivo dell’esperienza visuale negli scimpanzè.

Vi sono miriadi di altre differenze: il tipo-1 di cheratina umana dei capelli del cluster genico contiene uno pseudogene φHaA. Questo gene è funzionale negli scimpanzé e nei gorilla. La ragione per cui il gene umano è non funzionale è che ha una mutazione nonsenso nell’esone 4 a causa di un polimorfismo a singolo nucleotide (SNP).

Gli umani esprimono il gene Hal attraverso la corteccia del capello, mentre gli scimpanzé e i gorilla esprimono Hal in una metà della corteccia e HaA nell’altra metà. [1]

 Ci sono anche differenze nelle glicoproteine. Hacia scrive:

“Molte superfici cellulari delle glicoproteine sono modificate con acidi sialici come l’acido N-glicolilneuraminico (Neu5Gc). Le grandi scimmie africane e altri mammiferi non-umani hanno sostanziali quantità di Neu5Gc nella maggior parte dei tessuti, ad eccezione del cervello.

Al contrario, gli umani non hanno significative quantità di Neu5Gc in ogni tessuto a causa di una mutazione frame-shift nel gene umano che codifica l’acido CMP-sialico idrossilasi, che sintetizza CMP-NeuGc, un donatore ad alta energia usato nella decorazione delle glicoproteine con NeuGc. L’importanza biologica della perdita nell’uomo di Neu5Gc è sconosciuta. Chiaramente ha un effetto sui siglec (i membri della superfamiglia delle immunoglobuline che riconoscono gli acidi sialici), che riconoscono Neu5Ac (l’acido N-Acetilneuraminico) ed Neu5Gc differentemente. 

A differenza degli scimpanzé, la maggior parte dei macrofagi umani esprimono siglec-1 (sialoadesina) sulla loro superficie. Questi macrofaci sono localizzati in diverse regioni della milza di umani e scimpanzé.

La perdita di Neu5Gc può causare suscettibilità differenziale a patogeni che usano i ligandi di Neu5Gc per ottenere l’accesso alle cellule. Non si può escludere che la perdita di Neu5GC alteri la funzione delle glicoproteine nel cervello umano e potenzialmente colpisca lo sviluppo cerebrale”

Vi sono anche differenze nella suscettibilità alle malattie, manifestazione e risposta ai trattamenti, ciò nonostante i primati non umani sono usati come modelli sperimentali per studiare un’ampia gamma di patologie neurodegenerative umane.

Nel 1936, il neurologo portoghese Egas Moniz introdusse un’operazione chirurgica, per cui vinse il Premio Nobel nel 1949; la leucotomia prefrontale o lobotomia.
L’operazione consisteva in incisioni che distruggevano le connessioni tra la regione prefrontale e altre parti del cervello. Lesionare il cervello per trattare malattie mentali non era qualcosa di nuovo ma non era stato mai adottato così estesamente. Poi, ad una conferenza neurologica a Londra nel 1935, Jacobsen & Fulton presentarono i dati ricavati dall’operazione di due scimpanzé che, dopo una leucotomia, riuscivano a fare errori senza diventare aggressivi, cosa che non erano riusciti a fare prima. Moniz prese questi dati dagli scimpanzé e li applicò agli uomini. Operò su pazienti con disturbi affettivi, tra cui vari tipi di depressione, disturbo ossessivo-compulsivo, ipocondriaci e così via. Questa operazione rendeva gli umani più docili, come accadeva negli scimpanzé, ma distruggeva anche la loro personalità lasciandoli inattivi e senza memoria.

Marvanová et al. Usarono microarray umani per tracciare un profilo dei geni dal cervello di umani, macachi e uistitì, e li combinò con dati provenienti da scimpanzé e orangutan per creare un insieme di dati che rivelasse somiglianze e differenze nell’espressione dei geni sottostanti il morbo di Parkinson, di Alzheimer e la malattia di Huntington. [4]

Trovarono che un grande numero di geni sono espressi nella corteccia prefrontale umana e che una significativa percentuale di questi sono espressi anche nei primati non umani. Ma trovarono anche profonde differenze:

“Dei 12386 insiemi di ricerca analizzati nel chip Affymetrix U95A, 5460 (il 45%) geni nell’intero cervello umano erano “presenti.” Questo indica che almeno il 45% dei geni inclusi negli array umani sono stati scoperti nel cervello adulto umano. Nei tessuti prefrontali corticali il numero di geni presenti era: essere umano, 4794 (39%); scimpanzè, 4173 (34%); orangutan, 3501 (28%); macaco, 3376 (27%); uistitì, 2960 (24%). 

[…] Approssimativamente il 20% dei geni umani presenti aveva un diverso profilo di espressione (>2-fold change) negli scimpanzé e più del 25% di geni nell’orangutan, macaco e uistitì aveva un diverso profilo nell’espressione. Le aree di distribuzione furono generate per identificare i geni e comparare l’espressione degli esseri umani rispetto ai primati non-umani. Più dell’80% dei geni aveva un simile livello di espressione (<2-fold change) nell’uomo comparato con lo scimpanzé e più del 60% delle altre specie studiate. La percentuale di geni presenti nella corteccia prefrontale e che mostravano un diverso livello di espressione (>2-fold change) era, nello scimpanzè, il 18%; nell’orangutan, il 37%; nel macaco, il 26%; nell’uistitì, il 33%. Il numero di geni più altamente espressi (>2-fold change) negli umani/più altamente espressi nei primati non-umani, e il loro rapporto erano, nello scimpanzè (470/231 geni, 2.0), nell’orangutan (910/249 geni, 3.7), nel macaco (528/280 geni, 1.9), e nell’ uistitì (539/311 geni, 1.7).

I geni AD, PD e HD, implicati nelle comuni malattie neurodegenerative, contenevano differenze qualitative e quantitative nella corteccia prefrontale dei primati non-umani. Alcuni geni conosciuti per svolgere un ruolo nel morbo di Alzheimer si riscontravano negli umani e nei primati non-umani (PS1, amiloide AD, precursore dell’amiloide, CHRM3, tau, ubiquitina), ma altri non c’erano (apolipoproteina E, NMDAR2C, TNF-α). I sei geni che erano in relazione al sistema dopaminergico e di conseguenza probabilmente al morbo di Parkinson (ubiquitina, gamma-sinucleina, recettore della dopamina 1, MAOB, MAOA, COMT) esibivano una buona concordanza nell’uomo, nello scimpanzé e nell’orangutan (ad eccezione del recettore della dopamina 1), ma si osservarono punteggi assenti per il recettore della dopamina 1 e per la COMT nel macaco e per il recettore della dopamina 1, per la MAOA e per la COMT nell’uistitì. Il gene HD collegato alla malattia di Huntington non fu rilevato in alcuna specie testata e l’ HIP2 fu rilevato solo nella corteccia prefrontale di di scimmie a cui si era fatto un profilo. Dei 12 geni correlati ai meccanismi base (fattori di crescita e i loro recettori, fattori di trascrizione, citocinesi e molecole dell’apoptosi), 9 erano concordanti e 3 erano discordanti, principalmente nel caso delle corteccie prefrontali degli uistitì, con l’eccezione del trascritto Bcl-2, che non era stato rilevato nell’orangutan o nel macaco. Il recettore 2 del glutammato era sovraregolato e quattro geni implicati nella trascrizione erano sottoregolati in tutti i primati non-umani rispetto agli umani.

[…] Molti geni trovati nella patologia di Alzheimer (precursore dell’amiloide, CHRM3, tau e ubiquitina) furono trovati anche nei primati non-umani, mentre quelli assenti nella corteccia prefrontale umana (presenilina 1, amiloide AD) erano assenti nei primati non-umani. Parecchi geni correlati alla patologia della malattia di Huntington, come il gene HD, furono trovati nella corteccia prefrontale umana ma non nella corteccia prefrontale degli altri primati non-umani; la proteina 2 di Huntington (HIP2) non fu rileva
ta nelle cortecce prefrontali umana e delle scimmie antropomorfe mentre lo fu nelle cortecce prefrontali delle scimmie. Per di più, la COMT, un enzima con un ruolo nella degradazione della dopamina, era presente negli umani e nelle scimmie antropomorfe ma non fu rilevato in alcuna specie di scimmia testata […] Quattro geni implicati nella trascrizione erano sottoregolati almeno doppiamente in tutte le specie di primati non umani a differenza degli umani …”

Considerando il fatto che una differenza molto piccola tra due sistemi complessi può portare a modi molto diversi in cui i sistemi complessi agiscono, queste differenze non sono insignificanti.

Marvanova et al. [4] studiarono i profili di espressione genica di umani, scimpanzé e altri primati non-umani relativamente alle malattie neurologiche. Scrivendo nel “The FASEB Journal” nel 2003, gli autori conclusero:

“ 1. Un ampio numero di geni sono espressi nella corteccia umana prefrontale; una significativa percentuale di questi sono anche espressi nei primati non-umani.

2. Approssimativamente il 20% dei geni presenti nell’uomo aveva un profilo di espressione diverso (>2-fold change) negli scimpanzè e più del 25% dei geni nell’orangutan, nel macaco e nell’uistitì aveva un diverso profilo di espressione.

3. I geni AD, PD e HD, implicati nelle comuni malattie neurodegenerative contenevano differenze qualitative e quantitative nella corteccia prefrontale dei primati non-umani”

E’ interessante notare che gli autori concludevano che questi primati non-umani potessero essere apprezzabili modelli sperimentali nonostante le sopra menzionate differenze. E’ un errore come questo, fraintendendo il concetto di geni simili, scambiandolo con quello di funzioni genetiche simili.

Come menzionato prima, non sono i geni stessi che sono importanti, ma piuttosto come sono espressi. Considerando le differenze nei profili di espressione, non dovremmo essere sorpresi che lo scimpanzé reagisca differentemente all’ambiente e ai geni che negli umani producono l’Alzheimer, il Parkinson e così via.

Courtney et al. studiarono la memoria di lavoro negli umani e nelle scimmie. 

La loro analisi comparativa porta allo scoperto ciò che ci si poteva aspettare: l’esistenza di somiglianze e differenze. Sulle differenze scoperte il seguente testo ne fa specifica menzione:

“Primo, ci sono tre regioni prefrontali separate associate con la memoria di lavoro per gli oggetti negli esseri umani, di cui solo una è stata identificata nelle scimmie. Secondo, la regione frontale associata con la memoria di lavoro spaziale negli esseri umani occupa una locazione più dorsale e posteriore rispetto all’area omologa nelle scimmie. Tuttavia, come nella scimmia, in cui l’area specializzata per la memoria di lavoro spaziale è localizzata appena anteriore ai campi oculari frontali, la stessa relazione topologica esiste nell’uomo. Terzo, non c’è alcuna prova nelle scimmie della lateralizzazione emisferica dei processi di memoria di lavoro, mentre negli esseri umani l’emisfero sinistro sembra predominare per le rappresentazioni analitiche dell’oggetto, e il destro per la rappresentazione basata su immagini dell’oggetto”. [5]

Studi comparativi hanno anche rivelato l’importanza delle differenze nella regolazione genica nel cervello degli esseri umani e di altri primati. Varki et al. hanno così osservato:

“Nonostante gli studi basati sui microarray di espressione genica interspecie siano colpiti da varie questioni tecniche o metodologiche, rivelano alcuni temi principali. Primo, c’è un’apparente accelerazione nell’evoluzione dei geni arricchiti del cervello negli umani rispetto agli scimpanzé, assieme ad altri tessuti. Questa scoperta è stata interpretata per dimostrare una selezione positiva, ma è conforme anche ad un allentamento di restrizioni. Una seconda, collegata osservazione è che nel lignaggio umano ci sono maggiori aumenti nell’espressione genica che cali.
Questo può indicare una generale sovraregolazione dell’energia metabolica del cervello negli esseri umani, una caratteristica consistente con l’espansione della neocorteccia nel lignaggio umano. Terzo, un modello neutro è stato proposto per spiegare molti dei cambiamenti dell’espressione genica nel cervello, perché c’è una maggiore variazione nei geni arricchiti dei sistemi non-nervosi rispetto ai geni arricchiti del cervello.” [6]

Passiamo dunque all’uso dello scimpanzé negli studi cognitivi. Nessuno nega il fatto che se si voglia imparare qualcosa sul pensiero degli scimpanzé si debbano studiare gli scimpanzé. Se qualcuno vuole studiare le differenze tra il cervello umano e quello dello scimpanzé deve studiare sia il cervello umano che dello scimpanzé. L’anatomia comparata e la medicina comparata sono campi legittimi della scienza, tuttavia non sono sinonimi della ricerca biomedica che propone di offrire speranze alle persone che soffrono di Alzheimer, epilessia, sclerosi multipla, Parkinson e altre malattie del cervello e del sistema nervoso.

Inoltre, è da ingenui studiare la depressione o l’ansia negli scimpanzé, trovare il modo che soffrano e che soffrano nelle stesse situazioni in cui soffrirebbero gli esseri umani e definire questa scoperta “importante per gli esseri umani che soffrono di malattie mentali”. Se una persona desidera capire qualcosa sulla depressione umana, deve studiare gli umani. Semplicemente perché gli scimpanzé soffrono di malattie di cui soffrono anche gli esseri umani non significa che soffrano di queste malattie per lo stesso motivo, che manifestino la stessa psicopatologia o rispondano allo stesso modo agli stessi trattamenti.

Gli scimpanzé possono essere usati per la neuroanatomia e la neuropatologia degli scimpanzé, ma insinuare che questa conoscenza sia di beneficio agli esseri umani è falso e contrario ala corrente teoria biologica.

Riferimenti bibliografici:

[1] Hacia JG. Genome of the apes. Trends Genet. 2001 Nov;17(11):637-45.

[2] Wolgang Enard, Philipp Khaitovich, Joachim Klose, Sebastian Zollner, Florian Heissig, Patrick Giavalisco, Kay Nieselt-Struwe, Elaine Muchmore, Ajit Varki, Rivka Ravid, Gaby M. Doxiadis, Ronald E. Bontrop, Svante Paabo1 Intra- and Interspecific Variation in Primate Gene Expression Patterns. 12 April 2002 Vol 296 Science  340-43

[3] Crick F, Jones E.  Backwardness of human neuroanatomy. Nature. 1993 Jan 14; 361(6408): 109-10.

[4] Markéta Marvanová, Jean Ménager, Erwan Bezard, Ronald E. Bontrop, Laurent Pradier and Garry Wong. Microarray analysis of nonhuman primates: validation of experimental models in neurological disorders. The FASEB Journal. 2003;17:929-931.

[5] S M Courtney, Petit, Haxby, Ungerleider. The role of prefrontal cortex in working memory: examining the contents of consciousness. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 1998 November 29; 353(1377): 1819–1828.

[6] Varki A, Geschwind DH, Eichler EE. Explaining human uniqueness: genome interactions with environment, behaviour and culture. Nat Rev Genet. 2008 Oct;9(10):749-63. doi: 10.1038/nrg2428.

(liberamente tradotto da:
Animal Models in Light of Evolution – Niall Shanks, Ph.D. & C. Ray Greek, M.D.
e
A Scientific Case for the Elimination of Chimpanzees in Research – Greek, R., Greek, J., & Shanks, N. (2005). Written for Project R&R. Available from: http://www.releasechimps.org/pdfs/A_Scientific_Case_for_the_Elimination_of_Chimpanzee_Research.pdf)

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L’80% delle proteine sono differenti tra uomo e scimpanzè

Come tutti sappiamo, lo scimpanzè è il nostro più vicino parente, con cui condividiamo il 98-99% del DNA, tuttavia non è direttamente il DNA a operare, bensì le proteine da esso prodotte.
Questa differenza dell’1-2%, nella creazione delle proteine, diviene un 80% di discordanza:

“The chimpanzee is our closest living relative. The morphological differences between the two species are so large that there is no problem in distinguishing between them. However, the nucleotide difference between the two species is surprisingly small. The early genome comparison by DNA hybridization techniques suggested a nucleotide difference of 1-2%. Recently, direct nucleotide sequencing confirmed this estimate. These findings generated the common belief that the human is extremely close to the chimpanzee at the genetic level. However, if one looks at proteins, which are mainly responsible for phenotypic differences, the picture is quite different, and about 80% of proteins are different between the two species. Still, the number of proteins responsible for the phenotypic differences may be smaller since not all genes are directly responsible for phenotypic characters.”

[Glazko G, Veeramachaneni V, Nei M, Makałowski W. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene. 2005 Feb 14;346:215-9.]

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15716009

Sperimentazione Animale: fallimento scientifico

“Ogni anno milioni di animali vengono uccisi nei laboratori di tutto il mondo. 

Parte della comunità scientifica difende e giustifica l’uso di animali ritenendolo vitale per prevenire e curare le malattie [1, 2], oppure sostenendo che i più grossi successi della medicina siano da attribuirsi alla vivisezione [3] oppure che la complessità biologica dell’essere umano richieda organismi altrettanto complessi [4]. 

C’è chi si spinge a dire che un eventuale divieto di uso di animali sarebbe un evento “catastrofico” per la ricerca medica [5]. 

Tutte queste affermazioni però non sono supportate da effettive dimostrazioni scientifiche e validazioni ufficiali. 

Recentemente inoltre vari scienziati hanno analizzato i risultati ottenuti con animali nei laboratori confrontandoli con quelli ottenuti nell’uomo nelle cliniche ospedaliere. 

Il dr. Andrew Knight ha raccolto tutti questi studi e in particolare quelli condotti con protocolli di ricerca trasparenti e accettati in maniera oggettiva dall’intera comunità scientifica. 

La vivisezione si è rivelata una pratica totalmente inutile per curare malattie umane, ogni volta che è stata analizzata e valutata secondo parametri scientifici. 

Sono 27 in totale gli studi che hanno cercato di valutare il contributo della vivisezione alla ricerca medica (20 studi) e/o di valutare la capacità di predire la tossicità di una sostanza per l’uomo (7 studi) [6]. 

Soltanto 2 studi su 20, ma di cui 1 ambiguo, dichiarano che l’uso di animali sia utile in maniera significativa a migliorare la ricerca mentre i restanti 18 ne negano la validità. 

Nessuno dei 7 studi sulla tossicità riesce a dimostrare l’utilità scientifica dell’uso di animali. 

Anche altri ricercatori hanno studiato la validità scientifica della vivisezione. Riportiamo di seguito i principali risultati, suddividendoli in tre diversi ambiti: 

1) Studi da cui erano attesi significativi progressi nella ricerca medica 

Un gruppo di ricerca guidato dal prof. Lindl [7, 8] ha esaminato gli esperimenti su animali che erano stati approvati sulla base del fatto che sembrava potessero portare a progressi nella ricerca medica.

Si trattava infatti di esperimenti che sembrava avessero già avuto positivi e importanti risultati preliminari nonché varie pubblicazioni sulle riviste scientifiche. 

È stato valutato il contributo alla ricerca scientifica degli studi (17 in totale) che avevano queste caratteristiche. 

Su 1183 pubblicazioni scientifiche successive e collegate ai campi di ricerca studiati, la stragrande maggioranza si riferiva a miglioramenti ottenuti senza uso di animali e solo 4 casi citavano le suddette prove su animali. 

Inoltre tutti i risultati ottenuti su questi 4 casi hanno portato solo a fallimenti quando applicati all’uomo. 

Di conseguenza nessuno studio su animali, selezionato tra quelli che già risultavano i più promettenti ha portato a nuove terapie o a qualsiasi contributo positivo per l’uomo. 

Il prof. Lindl e i suoi colleghi concludono dicendo che, invece di autorizzarli anche quando considerati promettenti, gli esperimenti su animali dovrebbero essere vietati. 

2) Principali studi su animali seguiti, supportati e citati dalla comunità scientifica 

I dottori Hackam e Redelmeier [9] hanno usato un diverso metodo di valutazione. 

Hanno preso gli studi con animali più citati e pubblicizzati all’interno della comunità scientifica per vedere quanti di questi avessero poi portato alla successiva sperimentazione sull’uomo delle nuove terapie proposte e studiate su animali. 

Hanno analizzato i risultati ottenuti in 76 ricerche citate centinaia di volte da altri ricercatori (da un minimo di 639 e un massimo di 2233 citazioni). 
Nonostante fossero le ricerche più citate dalla comunità scientifica internazionale soltanto 28 (36.8%) hanno portato a una successiva valutazione per sperimentazione umana e, di queste, solo 8 (10.5%) sono state utilizzate sull’uomo. 

Per nessuna di queste è stato possibile dimostrare benefici mentre sono facilmente dimostrabili una serie di reazioni avverse tra le quali il decesso dei pazienti [10]. 

Nessun beneficio nonostante un totale di più di 67 mila citazioni da parte della comunità scientifica. 

Inoltre, indipendentemente dai risultati e dal contenuto, soltanto 37 studi su 76 dei più noti studi su animali rispettano i requisiti minimi dei moderni protocolli scientifici da un punto di vista statistico e metodologico. 

Di conseguenza gli autori della ricerca concludono avvisando pazienti e medici di non fidarsi dei risultati ottenuti su animali. 

3) Studi effettuati sugli scimpanzè 

Da un punto di vista genetico gli scimpanzè sono senza dubbio gli animali usati nei laboratori più simili all’uomo. 

Per questo motivo il dr. Knight ha svolto un’analisi specifica delle ricerche condotte su questi animali [11]. 

Ha analizzato 749 pubblicazioni di ricerche compiute tra il 1995 e il 2004 e ha selezionato quelle che utilizzavano un numero di animali significativo dal punto di vista statistico (come minimo 86). 

Soltanto 95 avevano un senso dal punto di vista statistico questo vuol dire che le restanti 654 ricerche erano e sono prive di qualsiasi valore scientifico indipendentemente dai risultati ottenuti [12, 13]. 

Di queste 95, ben 47 (49.5%) non sono state citate in nessun lavoro scientifico successivo attestando così un contributo assolutamente nullo alla ricerca scientifica. 

34 di queste (35.8%) vengono citate in pubblicazioni che chiaramente non descrivono nessun miglioramento per la ricerca scientifica. 

Soltanto 14 vengono citate in pubblicazioni che attestano miglioramenti ma, andando a leggere il contenuto delle pubblicazioni, si evidenzia chiaramente che il progresso scientifico era dovuto principalmente a studi clinici ed epidemiologici su pazienti umani, studi in vitro e saggi molecolari e non alle prove su animali. 

Motivi del fallimento scientifico della vivisezione 

Nonostante gli scimpanzè e gli uomini differiscano solo dell’1-2% dal punto di vista genetico, questa seppur minima differenza si traduce poi in una differenza dell’80% nella formazione delle proteine che portano a differenze nella progressione delle malattie, nell’assorbimento e nella distribuzione delle sostanze, nei tessuti, nell’escrezione di agenti chemioterapici, ecc. [14]. 

Ci sono quindi anche differenze nell’azione e nella tossicità delle sostanze farmaceutiche [11, 15] che invalidano l’uso anche delle specie animali più simili per ottenere informazioni utili per l’uomo. 

Nonostante la non utilità degli esperimenti sugli scimpanzè è indubbiamente vero che essi rimangono gli animali più simili all’uomo e quindi, l’utilizzo di altre specie animali può portare a risultati solo ancora peggiori. 

Normalmente gli animali più usati nella sperimentazione sono i roditori e sono inutili per la ricerca per i seguenti motivi [16, 17]: 

– stress creato dalle condizioni di stabulazione 

– differenze genetiche e metaboliche 

– stress creato dalla procedure di sperimentazione 

– differenze nelle risposte agli agenti tossici 

– dosi usate negli esperimenti troppo elevate e inadatte alle specie utilizzate 

Ma non solo, il fatto che la vivisezione sia poco considerata dal punto di vista scientifico anche da molti che la praticano è dimostrabile dalle scarse metodologie usate quando si usano animali che non tengono conto dei più moderni protocolli di ricerca e di analisi statistica. Quindi di fatto i risultati ottenuti con metodologie così scadenti non sono poi neppure utilizzabili neanche da chi crede ancora nella necessità della vivisezione. [18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28]. 

Ci sono solo due possibilità: 

a) i ricercatori credono nella sperimentazione su animali ma non sono capaci di farla 

b) i ricercatori non ci credono e quindi non dedi
cano sufficiente attenzione alle metodologie. 

Alla luce dei risultati degli studi riportati riteniamo più probabile la seconda ipotesi. 
In tutti i casi riteniamo corretto ribaltare il paradigma attualmente utilizzato secondo il quale l’uso di animali è automaticamente utile per sostituirlo con un paradigma scientifico molto più moderno e dimostrabile: la vivisezione è stata ed è soltanto 

– una crudeltà inutile per gli animali 

– uno sbaglio di gioventù per alcuni ricercatori 

– una speranza fallita per altri ricercatori 

– un dogma che non si può discutere, come se fosse un atto di fede e non una metodologia scientifica, soprattutto nell’ambiente accademico 

Per questo l’ATRA continuerà a denunciarne gli orrori e l’inutilità, a coordinare ricercatori che ne sono sempre stati contrari o lo sono diventati, a finanziare e sponsorizzare metodi di ricerca finalmente moderni, incruenti e tecnologicamente avanzati.” 

Bibliografia 
1) Brom, F. W. (2002). Science and society: different bioethical approaches towards animal experimentation. ALTEX 19(2), 78-82. 

2) Festing, M. F. W. (2004). Is the use of animals in biomedical research still necessary in 2002? Unfortunately, “yes”. ATLA 32 (Suppl. 1B), 733-739. 

3) Pawlik, W.W. (1998). The significance of animals in biomedical research. (Znaczenie zwierzat w badaniach biomedycznych.). Folia Medica Cracoviensia 39(3-4), 175-182. 

4) Kjellmer, I. (2002). Animal experiments are necessary. Coordinated control functions are difficult to study without the use of nature’s most complex systems: mammals and human beings. (Djurförsök är nödvändiga. Samordnade kontrollfunktioner låter sig svårligen studeras utan tillgång till naturens mest komplexa system: däggdjur och människa.). Lakartidningen 99(11), 1172-1173. 

5) Osswald, W. (1992). Ethics of animal research and application to humans (Etica da investigação no animal e aplicação ao homem). Acta medica portuguesa 5(4), 222-225. 

6) Knight, A. (2007). Systematic reviews of animal experiments demonstrate poor human clinical and toxicological utility. ATLA 35, 641-659. 

7) Lindl, T., Voelkel, M. and Kolar, R. (2005). Animal experiments in biomedical research. An evaluation of the clinical relevance of approved animal experimental projects. (German) ALTEX 22(3), 143-151. 

8 ) Lindl, T., Völkel, M. and Kolar, R. (2006). Animal experiments in biomedical research. An evaluation of the clinical relevance of approved animal experimental projects: No evident implementation in human medicine within more than 10 years. (Lecture abstract). ALTEX 23(2), 111.

9) Hackam, D. G. and Redelmeier, D. A. (2006). Translation of research evidence from animals to humans. J. Amer. Med. Assoc. 296(14), 1731-1732. 

10) Lazarou, J. and Pomeranz, B. (1998). Incidence of adverse drug reactions in hospitalized patients: a meta-analysis of prospective studies. J. Amer. Med. Assoc. 279, 1200-1205. 

11) Knight, A. (2007b). The poor contribution of chimpanzee experiments to biomedical progress. J. Appl. Anim. Welf. Sci. 10(4) 281-308. 

12) Guenther, W. C. (1973). A sample size formulafor the hypergeometric. Journal of Quality Technology 5(4), 167-170. 

13) Green, J. (1982). Asymptotic sample size for given confidence interval length. Applied Statistics 31(3), 298-300. 

14) Glazko, G., Veeramachaneni, V., Nei, M. and Makalowski, W. (2005). Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene 346, 215-219. 

15) Bailey, J. (2005). Non-human primates in medical research and drug development: a critical review. Biogenic Amines, 19(4-6), 235-255. 

16) Balcombe, J., Barnard, N. and Sandusky, C. (2004). Laboratory routines cause animal stress. Contemporary Topics in Laboratory Animal Science, 43(6), 42-51. 

17) Knight, A., Bailey, J. and Balcombe, J. (2006). Animal carcinogenicity studies: 2. obstacles to extrapolation of data to humans. ATLA 34(1), 29-38. 

18) Horn, J., de Haan, R. J., Vermeulen, M. et al. (2001). Nimodipine in animal model experiments of focal cerebral ischemia: a systematic review. Stroke 32(10), 2433- 2438. 

19) Lucas, C., Criens-Poublon, L. J., Cockrell, C. T. and De Haan, R. J. (2002). Wound healing in cell studies and animal model experiments by Low Level Laser Therapy; were clinical studies justified? A systematic review. Lasers in Medical Science 17 (2), 110-134. 

20) Roberts, I., Kwan, I., Evans, P. and Haig, S. (2002). Does animal experimentation inform human healthcare? Observations from a systematic review of international nimal experiments on fluid resuscitation. Brit. Med. J. 324, 474-476. 

21) Lee, D. S., Nguyen, Q. T., Lapointe, N. et al. (2003). Meta-analysis of the effects of endothelin receptor blockade on survival in experimental heart failure. J. Cardiac Fail 9, 368-374. 

22) Macleod, M. R., O’Collins, T, Horky, L. L. et al. (2005a). Systematic review and metaanalysis of the efficacy of melatonin in experimental stroke. J. Pineal Res. 38, 35- 41. 

23) Macleod, M. R., O’Collins, T., Horky, L. L. et al. (2005b). Systematic review and metaanalysis of the efficacy of FK506 in experimental stroke. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism 25(6), 1-9. 

24) Van der Worp, H. B., de Haan, P., Morrema, E. and Kalkman, C. J. (2005). Methodological quality of animal studies on neuroprotection in focal cerebral ischaemia. J. Neurol. 252, 1108-1114. 

25) Willmot, M., Gray, L., Gibson, C. et al. (2005a). A systematic review of nitric oxide donors and L-arginine in experimental stroke: effects on infarct size and cerebral blood flow. Nitric Oxide 12, 141-149. 

26) Willmot, M., Gibson, C., Gray, L. et al. (2005b). Nitric oxide synthase inhibitors in experimental ischemic stroke and their effects on infarct size and cerebral blood flow: a systematic review. Free Radical Biology & Medicine 39, 412–425. 

27) Hackam, D. G. and Redelmeier, D. A. (2006). Translation of research evidence from animals to humans. J. Amer. Med. Assoc. 296(14), 1731-1732. 

28 ) Perel, P., Roberts, I., Sena, E. et al. (2007). Comparison of treatment effects between animal experiments and clinical trials: systematic review. Brit. Med. J. 334, 197-200.

(tratto da un articolo di Massimo Tettamanti 
Chimico ambientale e tossicologo. 
Chief Executive Officer del centro I-CARE (International Center for Alternatives in Research and Education). 
Membro dell’Altweb Project Team della John Hopkins University di Baltimora, USA.)

Il futuro della ricerca in teratologia è in vitro

Le malformazioni congenite indotte dall’esposizione materna ad agenti esogeni durante la gravidanza sono prevenibili, se gli agenti stessi possono essere identificati ed evitati. Per decenni, sono stati dedicati miliardi di dollari e di ore di lavoro umano a studi su animali e metodi di caratterizzazione. In questo articolo mostriamo, attraverso una revisione e analisi sistematica globale dei dati disponibili, che la scientificità di questi metodi e’ opinabile e che essi costituiscono un pericolo per gli esseri umani.

La loro predittività media, in positivo e in negativo, supera appena il 50%; la discordanza dei dati tra specie diverse e’ sostanziale; l’estrapolazione affidabile dei risultati su animali al caso umano e’ impossibile, e praticamente tutte le sostanze teratogene (NdT: che provocano malformazioni nel feto) per gli umani sono state fino ad ora identificate NONOSTANTE, piuttosto che grazie a, i metodi basati su animali.

Nonostante i criteri di convalida stringenti, che gli studi di teratologia basati su animali non avrebbero mai passato, tre alternative in vitro hanno superato la convalida. L’embryonic stem-cell test (test sulle cellule staminali embrionali), EST, e’ il migliore tra questi.

Noi sosteniamo che la scarsa efficacia dei test di teratogenicità basati su animali dovrebbe gia’ da sola giustificare la cessazione di questo genere di test; essi dovrebbero essere sostituiti dai test EST, piu’ facili, meno costosi e maggiormente ripetibili, e dovrebbero essere messe a disposizione risorse per migliorare ulteriormente questo e altri test.”

“Abstract—Birth defects induced by maternal exposure to exogenous agents during pregnancy are preventable, if the agents themselves can be identified and avoided. Billions of dollars and manhours have been dedicated to animal-based discovery and characterisation methods over decades.

We show here, via a comprehensive systematic review and analysis of this data, that these methods constitute questionable science and pose a hazard to humans. Mean positive and negative predictivities barely exceed 50%; discordance among the species used is substantial; reliable extrapolation from animal data to humans is impossible, and virtually all known human teratogens have so far been identified in spite of, rather than because of, animal-based methods. Despite strict validation criteria that animal-based teratology studies would fail to meet, three in vitro alternatives have done so. The embryonic stem-cell test (EST) is the best of these. We argue that the poor performance of animalbased teratology alone warrants its cessation; it ought to be replaced by the easier, cheaper and more repeatable EST, and resources made available to improve this and other tests even further.”

[Bailey J, Knight A, Balcombe J. The future of teratology research is in vitro. Biogenic Amines 2005;19(2): 97-145.]

FULL TEXT: http://www.aknight.info/publications/anim_expts_tox/teratol/JB%20et%20al%20Teratol%20Biog%20Amines%202005%2019(2)%2097-146.pdf

Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte III – FINALE

RICERCA SUL CANCRO

Epidemiologia. Il termine epidemiologia deriva dal greco e letteralmente significa “studio sul popolo”. Essa è l’estensione dello studio della malattia dall’individuale al collettivo. Le indagini epidemiologiche si rivolgono a interi gruppi di individui o popolazioni e includono l’osservazione dell’andamento della malattia, l’individuazione delle cause e dei fattori di rischio che ne possono indurre l’insorgenza e condizionarne la diffusione, gli studi sullo stato di salute della popolazione e quelli per individuare gli interventi atti a migliorare le condizioni di vita. Scopo principale delle indagini epidemiologiche è quindi la scoperta delle cause e dei fattori che determinano l’insorgenza delle malattie o insidiano il benessere della popolazione.
Caratteristica importante di questa metodologia è quella che tutti i dati sono ricavati dalla diretta osservazione della specie umana e quindi dei tumori spontanei che la colpiscono.
In particolare le ricerche epidemiologiche sul cancro permettono di individuare le differenze quantitative e qualitative nella sua distribuzione geografica. Si cerca una risposta alle seguenti domande:
se in una popolazione (di paesi diversi o dello stesso paese) il cancro ha maggiore (o minore) incidenza quali sono le abitudini di vita capaci di giustificare tale scarto dai valori medi? quali condizioni di vita possono giustificare la maggiore (o minore) incidenza di un particolare tipo di cancro? quanto è dovuto a fattori ambientali e quanto a fattori genetici o razziali?
Oltre a quello eclatante del fumo di sigaretta diversi sono i casi che mostrano come l’epidemiologia può avere un valore determinante per lo studio di malattie di cui ancora non si conosce la causa: per esempio constatando la maggiore incidenza del cancro cutaneo negli europei emigrati ai tropici, si è potuta correlare la malattia con l’eccessiva irradiazione ultravioletta (le pelli scure sono protette dalla melanina); il carcinoma del testicolo è raro nei neri di tutto il mondo*, una nozione che soltanto il metodo epidemiologico poteva fornirci e che porta ad una domanda: che cosa difende gli uomini di colore dal cancro al testicolo?
Il cancro del colon e del retto è frequente in Europa e nell’America settentrionale. Nel Giappone è raro, ma raggiunge la frequenza propria della popolazione statunitense, nei giapponesi immigrati negli USA.
Ciò fa pensare ad una causa legata ad un fattore ambientale e non alla razza.
Le ricerche dovrebbero essere incrementate, ed orientate verso l’obiettivo di identificare i marker biologici della carcinogeneticità, come le alterazioni cromosomiche, la presenza di agenti mutageni nei fluidi corporei, i marker cellulari dell’esposizione, e la presenza di enzimi disintossicanti, attivati dalle sostanze cancerogene. Ciò faciliterebbe l’individuazione dei primi segni di carcinogeneticità per la popolazione umana.

Ricerca in vitro:
(Vedi anche test di cancerogenesi nella parte I)
Riguardo al cancro i metodi in vitro hanno fornito informazioni che non sarebbero mai state scoperte con alcun altro metodo, quali:
• l’indipendenza delle cellule cancerose dalla membrana basale e dal mesenchima;
• la labilità dei legami che tengono unite tra loro le cellule cancerose;
• la trasformazione “spontanea” delle cellule normali in cellule cancerose.
Quest’ultimo è il fenomeno più sconcertante, ma anche il più promettente per gli studi sulla genesi del cancro, che il modello animale non può offrirci.

Le analisi sulla trasformazione cellulare individuano quei mutamenti morfologici, che forniscono i primi segni identificabili della carcinogenesi. Tra i forti vantaggi logistici dei test in vitro rispetto a quelli in vivo sui roditori, vanno ricordati la breve durata (da ore a giorni), il notevole risparmio economico, e le minuscole quantità (dai microgrammi ai nanogrammi) di sostanze chimiche richieste, cosa che garantisce maggiore sicurezza per gli operatori e l’ambiente.

Tessuti umani ricostruiti: strutture tridimensionali di cellule coltivate su un sistema di supporto, sviluppati per l’occhio, la pelle il polmone, il tratto gastrointestinale e i rivestimenti della bocca e della vagina e nell’industria già sostituiscono gli animali in una vasta gamma di test. Questi studi permettono di prevedere le conseguenze funzionali come le alterazioni genetiche o i cambiamenti nella crescita cellulare, che una molecola può causare su una cellula del corpo umano. Recentemente la AP Reserch di Baltimora ha messo ha punto un sistema di coltivazione simultanea di più tessuti, che è in grado di simulare interazioni complesse come la trasformazione di un prodotto chimico in un altro causata dal metabolismo di un organo, che a sua volta influenza gli altri**.

Ricerca in silico

Microarray a DNA:
La tecnologia dei microarray a DNA è già stata descritta precedentemente. Questa metodologia di analisi promette anche risultati importanti per l’individuazione precoce di mutamenti nell’espressione dei geni, dovuti a sostanze cancerogene o altre tossine, molto prima dello sviluppo di effetti più invasivi, grazie alla capacità di esaminare molti geni simultaneamente.
Nel 2003 “New Scientist” pubblicò l’articolo “The cancer revolution”***, in cui si descrivevano i progressi effettuati nella ricerca contro il cancro grazie ai microarray:
– presso l’Università del North Carolina, è stato scoperto che il cancro al seno può originarsi da diversi tipi cellulari, non solo uno, come si sospettava precedentemente;
– presso la Novartis Research Foundation di San Diego sono stati chiariti alcuni meccanismi della metastasi e osservato la differenza rispetto a quanto si credeva dai test su animali.

Riferimenti:
* Hill MJ, Drasar BS, Hawksworth G, Aries V, Crowther JS, Williams RE. Bacteria and aetiology of cancer of large bowel. Lancet. 1971 Jan 16;1(7690):95-100.

** Goldberg AM, Hartung T. Protecting more than animals. Sci Am. 2006 Jan;294(1):84-91.

*** Hamilton, Garry. The cancer revolution. New Scientist;8/23/2003, Vol. 179 Issue 2409, p36
ABSTRACT: http://connection.ebscohost.com/c/articles/10713533/cancer-revolution%5D

RICERCA SULL’AIDS

– Studi epidemiologici:
Lo studio degli stili di vita ha contribuito in modo cruciale alla comprensione della malattia, correlando la sua diffusione a particolari costumi come ad esempio lo scambio di siringhe tra tossicodependenti.

– Studi clinici:
Venivano eseguiti già nel 1987 alla George Town University di Washington e ancora oggi vengono eseguiti sui numerosi individui infetti da HIV ma che non contraggono l’AIDS. Essi hanno dimostrato, ad esempio, che la produzione di sostanze naturali da parte dell’organismo (chiamate chemochine) può essere responsabile della protezione naturale contro l’AIDS [1].

– Metodi genetici e biomolecolari:
L’HIV venne isolato dai tessuti di pazienti infetti e studi genetici ne hanno delineato meglio le caratteristiche, non gli esperimenti su animali.
Lo stesso Prof. Gallo, un pioniere della ricerca sull’AIDS, menziona principalmente contributi scientifici provenienti dalla ricerca biomolecolare, non test su animali [2]: oltre alle già citate chemochine, la comprensione della struttura esterna dell’HIV, il modo in cui entra nelle cellula e l’importanza dei fattori genetici.

– Metodi in vitro:
Grazie a test su cellule e tessuti venne scoperta la struttura di un importante enzima dell’HIV, aiutando a sviluppare i primi farmaci [3]. Lo studio su tessuti da donatori, come linfonodi, ha consentito di comprendere l’interazione dell’HIV con il sistema immunitario. Sono poi utilizzabili colture di cellule dall’epitelio di retto e vagina umani per comp
rendere l’attività del virus a questo livello.

– Metodi in silico:
Negli anni ‘90 vennero sviluppati modelli che spiegavano il ciclo dell’HIV nel corpo dei pazienti aiutando a sviluppare terapie mirate [4]. Più recentemente ne sono stati sviluppati altri come l’HAART del Virginia Bioinformatics Institute che modella il metabolismo del farmaco AZT nell’organismo umano [5].

Riferimenti:
[1] Garzino-Demo A, Moss RB, Margolick JB, Cleghorn F, Sill A, Blattner WA, Cocchi F, Carlo DJ, DeVico AL, Gallo RC. Spontaneous and antigen-induced production of HIV-inhibitory beta-chemokines are associated with AIDS-free status. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Oct 12;96(21):11986-91.
FULL TEXT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC18399/

[2] Robert C Gallo. A reflection on HIV/AIDS research after 25 years. Retrovirology. 2006; 3: 72.

[3] S Seelmeier, H Schmidt, V Turk, and K von der Helm. Human immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited by pepstatin A. Proc Natl Acad Sci U S A. 1988 September; 85(18): 6612–6616.

[4] Wei X, Ghosh SK, Taylor ME, Johnson VA, Emini EA, Deutsch P, Lifson JD, Bonhoeffer S, Nowak MA, Hahn BH, et al. Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection. Nature. 1995 Jan 12;373(6510):117-22.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/7529365

[5] Patrick C. Bradshaw, Jiaxin Li, and David C. Samuels. A computational model of mitochondrial AZT metabolism. Biochem J. 2005 December 1; 392(Pt 2): 363–373.
FULL TEXT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1316272/

STUDIO DI MALATTIE GENETICHE

Studi clinici:
– Diagnosi prenatale: la genetica medica si prefigge di controllare le malattie genetiche attraverso la prevenzione e la diagnosi finalizzata all’applicazione di cure specialistiche adeguate. Analisi genetiche (il DNA si estrae facilmente e rapidamente dal sangue) e l’esame dell’albero genealogico dei futuri genitori del nascituro permettono di prevedere la possibilità di insorgenza di una malattia genetica e quindi di prevenirla o di trattarla adeguatamente.
Il prelievo di cellule fetali dai villi coriali attorno alla decima settimana di gravidanza e quello del liquido amniotico attorno alla sedicesima settimana consentono di acquisire materiale genetico del feto da analizzare permettendo di escludere la maggior parte delle patologie cromosomiche numeriche o strutturali responsabili di molte sindromi genetiche.

– La metodica della FISH (Ibridazione Fluorescente In Situ) permette di determinare, attraverso l’utilizzo di sonde molecolari marcate, una specifica mutazione responsabile di una malattia genetica.
La PCR, tecnica che consiste nell’amplificazione di una specifica sequenza di DNA, permette con assoluta precisione di rivelare la presenza di una malattia di cui si sospetta l’insorgenza, quali la fibrosi cistica, malattia molto diffusa a causa della frequenza assai elevata con cui la mutazione responsabile viene riscontrata nella popolazione (all’incirca 1:20). La PCR è una tecnica che rivoluzionato la ricerca biomedica negli ultimi anni e non deve nulla alla sperimentazione animale.
In passato, tecniche molto semplici, come l’osservazione al microscopio dei cromosomi, ha consentito di comprendere l’origine di malattie come la sindrome di Down. Dal 2003 è disponibile la mappatura del genoma umano, frutto di un progetto internazionale (Human Genome Project) iniziato nel 1990: la conoscenza dei geni e del loro ruolo si può valutare studiando persone con disfunzioni per capire se esse dipendano dal mal funzionamento, dalla mancanza o dall’aggiunta segmenti di DNA.

È possibile ottenere informazioni sulla funzione di un gene non noto confrontando la proteina da esso prodotta con proteine dalla struttura simile archiviate in databases; inoltre, grazie all’impiego di DNA chip, è possibile raccogliere un numero elevato di dati per paziente, che confrontati con i
dati di altri pazienti, consentono di studiare poliformismi genetici (diverse forme di uno stesso gene) e quindi eventuali associazioni tra geni e malattie ed eventualmente la funzione stessa del gene. Ad esempio si possono confrontare i profili genetici di tessuti normali e tessuti cancerosi per evidenziare eventuali componenti genetiche della malattia.

Un software per lo studio della funzione dei geni senza ricorrere ad animali è prodotto dalla Molecular Applications Group [1] (California).

Studi clinici, di popolazione e studi su gemelli identici: alcune popolazioni umane possono differire per incidenza di una malattia sia per ragioni legate ad abitudini di vita sia per caratteristiche genetiche.

Anche lo studio su gemelli identici aiuta a comprendere meglio la genetica umana evidenziando anche quanto le cause di patologie come il cancro, l’asma, l’osteoporosi, l’artrite o il diabete siano causate da fattori ambientali e quanto da genetici. Presso l’Istituto Superiore di Sanità esiste il Registro Nazionale dei Gemelli; si conducono studi sulla celiachia [2]; sul ruolo genetico delle patologie più comuni (progetto europeo GenomEutwin: http://www.genomeutwin.org); sui meccanismi della coagulazione del sangue per comprendere situazioni patologiche che portano alla formazione di trombi e all’ictus cerebrale (progetto europeo Euroclot [3]).

Metodi in silico:
Il computer sta diventando uno strumento sempre più importante nella ricerca genetica: un esempio è il supercomputer Avogadro, progettato dall’azienda italiana Eurotech, in grado di analizzare enormi quantità di dati genetici. Avogadro si trova presso LitBio, il laboratorio interdisciplinare di tecnologie bioinformatiche a Milano. [4]

Riferimenti:
[1] Lee C, Irizarry K. The GeneMine system for genome/proteome annotation and collaborative data mining. IBM Syst J. 2001;40:592–603.

Parker DS, Gorlick MM, Lee CJ. Evolving from bioinformatics in-the-small to bioinformatics in-the-large. OMICS. 2003 Spring;7(1):37-48.
FULL TEXT: http://www.cs.ucla.edu/~stott/bioinf/OMICS.7.1.p37-48.pdf

[2] Nistico, L; Cotichini, R; Fagnani, C; Stazi, MA; Coto, I and Greco, L. Concordance, Disease Progression and Heritability of Celiac Disease in Italian Twins. Twin Research and Human Genetics, Vol. 7, No. 4, Aug 2004: 369-370.

[3] Carter AM, Cymbalista CM, Spector TD, Grant PJ. Heritability of clot formation, morphology and lysis: The EUROCLOT study. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology 2007, 27:2783-2789

[4] http://www.eurotech.com/it/sala+stampa/news/?214

NEUROSCIENZE

Non includeremo questo argomento nel dossier perchè ne abbiamo già parlato nei seguenti articoli:
https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/16/rimpiazzare-gli-animali-nelle-neuroscienze/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/07/alternative-in-psicologia-e-nelle-neuroscienze-le-reti-neurali/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/16/ricerche-sul-cervello-inaffidabili-modello-animale-vs-neuroimaging/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/14/fettine-di-tessuto-cerebrale-umano-in-vitro/

http://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/02/26/microstimolazione-elettrica/

https://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2012/12/14/studio-sullepilessia-con-i-metodi-alternativi/

DIDATTICA

Nonostante l’impiego di animali a fini didattici sia quantitativamente marginale rispetto al totale (circa 0,3%), l’impatto è rilevante per la formazione scientifica e morale dello studente. 
Il Decreto Legislativo 116/92 stabilisce anche che l’impiego di metodi sostitutivi debba sempre essere preferito, inoltre rende particolarmente restrittivo il ricorso agli animali a scopo didattico attraverso la necessità di rilascio di una specifica autorizzazione.
In ambito didattico c’è una più che ampia disponibilità di metodi sostitutivi all’uso di animali.
Stando alle statistiche ufficiali, l’impiego principale sembra essere l’addestramento chirurgico.
L’evoluzione tecnologica ha portato innovazioni notevoli nella chirurgia: lo sviluppo della chirurgia
miniinvasiva ha aperto nuovi scenari: grazie alle fibre ottiche, in certe situazioni è possibile operare non “a cielo aperto” ma praticando piccoli fori sul corpo del paziente atti a inserire i mezzi di ripresa video e gli strumenti. Il chirurgo quindi osserva la scena da uno schermo e maneggia strumenti diversi dai tradizionali. Questa procedura, essendo del tutto nuova rispetto alle precedenti, non può essere improvvisata e richiede un training specifico, anche per i chirurghi esperti.
D’altra parte è fortemente avvertita in questo momento l’esigenza di una migliore formazione della classe medica, anche dagli stessi operatori sanitari, che desiderano acquisire validi fondamenti per affrontare più serenamente la pratica clinica.

Sia nell’addestramento degli apprendisti sia nell’aggiornamento dei medici esperti in alcuni casi si è fatto e si fa uso di animali, ma proprio perché si è manifestata l’esigenza di un innalzamento qualitativo nell’istruzione e nelle prestazioni, recentemente si è fatta strada la tendenza a ricorrere a simulatori, cioè apparecchiature artificiali in grado di mimare con precisione le caratteristiche dell’organismo umano, che è il vero oggetto della pratica del medico. La simulazione in medicina sta dando impulso a un effettivo e proficuo rinnovamento nella didattica.
Per simulatore non si intende solo il tradizionale “manichino”, peraltro molto utile in fase iniziale, perché grazie alle applicazioni dei computer e alla realtà virtuale oggi si dispone di strumenti molto più raffinati, che permettono di interagire con le strutture anatomiche.
Gli stessi manichini hanno subito una significativa evoluzione e oggi, oltre all’osservazione delle strutture anatomiche, sono possibili manovre diagnostiche e chirurgiche, come l’esecuzione di suture o iniezioni. Inoltre, grazie alle tecniche di visualizzazione con computer, possiamo osservare organi e formazioni anatomiche da varie angolazioni, scomporli in parti, sezionarli virtualmente ecc.
Vantaggi nell’uso dei simulatori rispetto agli animali:
– il simulatore riproduce le caratteristiche anatomiche e fisiologiche dell’essere umano, quindi è un
vero modello semplificato dell’organismo umano
– utilizzando l’animale, si rischia di adattare le manovre operative all’anatomia dell’animale stesso,
dovendo poi fare attenzione, una volta passati a operare sull’uomo, a riconoscere le differenze fra le
due specie, creando cioè una difficoltà in più, invece che semplificare il processo di apprendimento
– sul simulatore si possono studiare prima l’anatomia e la fisiologia di un organismo sano, comprese
tutte le varianti che rientrano nel quadro della normalità, e in seguito passare al patologico
– c’è la possibilità di annoverare una vasta gamma di situazioni cliniche, anche quelle rare, e avere così un quadro completo di tutte le evenienze alle quali ci si può trovare di fronte nella pratica clinica
– sono possibili lunghe fasi di apprendimento senza la continua presenza di un insegnante
– si può predisporre un gradiente di complessità e difficoltà con vari “livelli”
– l’esperimento può essere ripetuto un numero indefinito di volte
– l’eventuale errore non comporta alcun danno
– il computer può operare una continua verifica degli errori
– il livello di preparazione tra i diversi studenti e istituti viene maggiormente uniformato
– il simulatore può essere usato per eseguire test di valutazione dell’apprendimento (sarebbe così possibile inserire una parte pratica in tutti gli esami del corso di studi, cosa che a tutt’oggi non viene fatta).
Lo svantaggio più limitante è forse quello di non essere riusciti a simulare situazioni come il sanguinamento, sebbene si stia progredendo anche in questo campo.

Un’alternativa è l’impiego di cadaveri: è recente il brevetto del Dipartimento di Neurochirurgia dell’Università dell’Arkansas che consiste nell’impiego di cadaveri o parti di essi perfusi per esercitazioni di chirurgia [1]. La perfusione consiste nel far circolare del liquido pulsante all’interno dei vasi del cadavere, simulando in questo modo la circolazione sanguigna e la consistenza dei tessuti vivi, ovviando così al limite tecnico dell’impiego del cadavere. In Italia tuttavia, l’uso del cadavere è impedito per ragioni culturali e ostacolo normativi, mentre è diffuso in Francia: molti chirurghi italiani si recano oltralpe per questa ragione.
Qualche esempio italiano ed estero:
– Il Visibile Human è un atlante anatomico multimediale di 55 gigabyte, ottenuto da due volontari, un uomo e una donna, che hanno destinato i loro corpi, dopo la morte, alla realizzazione di questo progetto. I corpi sono stati congelati e poi affettati in sezioni sottili, che sono state fotografate, analizzate con la TC (tomografia computerizzata) e la RM (risonanza magnetica) e infine digitalizzate. Elaborando le immagini si sono ricavate ricostruzioni tridimensionali. L’utente può anche ricavare sezioni trasversali, sagittali, oblique di un organo, o visioni in movimento. Il Visible Human può anche essere usato come base per l’allestimento di modelli tridimensionali materiali.
In Italia il Cilea (Consorzio Interuniversitario Lombardo per l’Elaborazione Automatica) in collaborazione col Politecnico di Milano gestisce il “mirror site” del Visibile Human, che contiene l’intera banca dati per l’Europa continentale: http://www.nlm.nih.gov/research/visible/vhpconf98/AUTHORS/GUGLIELM/GUGLIELM.HTM Un piccolo campione di queste immagini, visibile senza registrarsi al sito, è disponibile su
http://www.nlm.nih.gov/research/visible/visible_human.html, mentre chi vuole scaricare tutto il materiale o parte di esso può farlo gratuitamente richiedendolo però al gestore del sito.

– Michelangelo è stato realizzato al Politecnico di Milano: è un robot capace di simulare le principali malattie cardiache, riproducendo anche i rumori cardiaci e permettendo così agli studenti di imparare a effettuare correttamente le manovre diagnostiche; fa parte della simulazione anche l’elettrocardiogramma.

– A Napoli, a Città della Scienza, si trova MEDISIM, Centro di Simulazione per la Formazione Medico Chirurgica ed Infermieristica. Qui si utilizzano due robot, un adulto e un bambino, per la simulazione di emergenze cardiologiche e respiratorie, eseguendo su di essi manovre di rianimazione, somministrazione di gas anestetici e di farmaci, intubazione e ventilazione, defibrillazione, assistenza a traumi e fratture.

– A questo scopo è utilizzato il manichino SAM, che simula diverse condizioni di emergenza medica e già adottato in un progetto formativo per l’addestramento di 600 medici nella Regione Veneto.

– Presso l’Università degli Studi di Roma “Tor Vergata” è in corso il progetto OPTIMISE: Ottimizzazione della sicurezza del PazienTe chirurgico attraverso l’Integrazione di Modelli simulativi ed Intefacce Sensoriali, che si propone la realizzazione di un simulatore inno
vativo utilizzabile sia in chirurgia open (tradizionale) sia mini-invasiva, sufficientemente economico da poter essere acquistabile dai centri di formazione chirurgica. L’utilizzo di questo simulatore consentirà di effettuare gli interventi più complessi in modo virtuale prima del vero intervento, in modo che il chirurgo possa prepararsi ai passaggi più difficili della procedura senza rischi per il paziente.

– In Sardegna, a Pula (CA) si trova il CRSSSS (Center for Advanced Studies Research and Development in Sardinia, http://www.crs4.it), un centro di ricerca interdisciplinare che sviluppa tecniche avanzate di simulazione tramite il computer, e che si occupa tra le altre cose anche di applicazioni biomediche. Tra i progetti in corso c’è IERAPSI (Integrated Environment for Rehearsal and Planning of Surgical Intervention), finalizzato allo studio di metodiche di addestramento e pianificazione chirurgica. Nell’ambito di questo progetto è stato realizzato un sofisticato simulatore per la chirurgia dell’osso temporale. Infatti i simulatori si possono utilizzare anche per la pianificazione chirurgica, per interventi in cui si richieda un elevato livello di precisione: si acquisiscono preventivamente immagini del corpo del paziente tramite TC e RM, e da queste si elabora la ricostruzione tridimensionale che viene usata per la simulazione dell’intervento.
Nel dispositivo in questione il chirurgo interagisce con un display e due manopole, che trasmettono i movimenti delle sue mani agli strumenti chirurgici virtuali che agiscono all’interno del campo operatorio. Le manopole gli forniscono anche il force-feedback, cioè un ritorno di sensazioni tattili in tempo reale. Egli può cioè avvertire la consistenza e la resistenza che il tessuto offre agli strumenti chirurgici: un dispositivo di questo tipo è detto APTICO (haptic). In questa simulazione c’è anche una efficace resa degli effetti visivi secondari che vengono prodotti dall’azione degli strumenti sull’osso: l’erosione, il “fango” prodotto dalla fresa, il sanguinamento, l’irrigazione prodotta dal trapano, l’effetto dell’aspiratore chirurgico ecc. Tutto ciò costituisce uno scenario che si modifica istantaneamente, mano a mano che l’azione virtuale dell’operatore sulle strutture anatomiche ne modifica l’assetto. C’è anche la possibilità di confrontare la realtà con la simulazione: su http://www.crs4.it/vic si possono guardare in contemporanea il filmato reale (fatto in endoscopia) e quello simulato.

– Presso l’Università degli Studi di Pisa è stato creato ENDOCAS, un centro di eccellenza per la chirurgia assistita al calcolatore (computer-aided surgery). Il programma di ricerca del centro verte, oltre che sulla chirurgia assistita, in cui le capacità del chirurgo si sommano alle potenzialità offerte dal computer, anche sulla creazione di materiale didattico innovativo e di simulatori.

Una curiosità: negli Stati Uniti alla scuola di Medicina dell’Ospedale Mount Sinai di NewYork si è anche pensato di creare il cosiddetto paziente standardizzato. Per questo scopo vengono assunti degli attori che devono “imparare la parte” del malato in modo da stimolare l’abilità degli apprendisti nell’individuare i sintomi e fare diagnosi (www.mc.uky.edu/meded/cstac/standpt.asp) [2].

Su http://www.interniche.org è disponibile un database di molti metodi utilizzabili nella didattica, e la possibilità di ottenerli in prestito.

Su http://www.ethical-learning.org è disponibile un database interattivo sui metodi sostitutivi nella didattica scientifica, creato da I-CARE (International Center for Alternatives in Research and Education, http://www.icare-worldwide.org/).
Il database contiene circa 900 alternative per più di 200 specie animali. Se si vogliono conoscere le possibili alternative a uno specifico esperimento, si compilano i campi relativi alle caratteristiche dell’esperimento (argomento e specie animale), e si ottengono i link ai siti internet o i contatti delle ditte che forniscono il relativo simulatore. Il sito fornisce altresì numerosi link a enti o istituzioni che si occupano di metodi sostitutivi, per esempio: ALTBIB, Bibliography on Alternatives to the Use of Live Vertebrates in Biomedical Research and Testing, http://toxnet.nlm.nih.gov/altbib.html; FRAME, Fund for the Replacement of Animals in Medical Experiments, http://www.frame.org.uk .

In ambito odontoiatrico, un numero notevole di corsi di perfezionamento utilizzano simulatori, soprattutto per l’apprendimento di procedure di particolare delicatezza (per es. la preservazione dell’integrità del nervo alveolare mandibolare durante l’inserimento di impianti in questa sede,
http://www.jetimplant.com/Catalogo/Catalogo.pdf, pag 122). Inoltre all’estero si tengono corsi di dissezione e procedure chirurgiche. In altri casi non si usano animali da laboratorio ma parti di essi provenienti dal “circuito alimentare” (testa del maiale recuperata dalla macelleria).

Si usano anche denti estratti, denti artificiali in gesso o resina, modelli trasparenti, manichini su cui possono essere montati sia denti artificiali che naturali.

Altri link:
http://www.mc.manchester.ac.uk/services/highperformancevisualization/haptics
http://www.sve.man.ac.uk/mvc: sito del Manchester Visualization Center
http://www.anatomy.tv: dissezioni anatomiche virtuali, elaborate graficamente
http://www.mc.uky.edu/meded/cstac/sims.asp: Università del Kentucky, simulatori
http://www.websurg.com: archivio di filmati sulla chirurgia mini-invasiva e laparoscopica
http://www.sensable.com/industries-medical-dental.htm: visualizzazioni 3D e simulatori
Simulatori in medicina veterinaria:
University of California Davis Centre for Animal Alternatives Information
http://lib.ucdavis.edu/dept/animalalternatives/index.php
http://www.rescuecritters.com: simulatori per esercitazioni su procedure veterinarie e tecniche di salvataggio di animali.

Riferimenti:
[1] Emad Aboud, Carlos Ernesto Suarez, Ossama Al-Mefty and M. Gazi Yasargil. New Alternative to Animal Models for Surgical Training. ATLA 32, Supplement 1, 501–507, 2004
FULL TEXT: http://www.frame.org.uk/atla_article.php?art_id=680&pdf=true

[2] SA Haist, AR Hoellein, G Talente, ML Jessup, JF Wilson. Improving Students’ Sexual History Inquiry and HIV Counseling with an Interactive Workshop Using Standardized Patients. J Gen Intern Med. 2004;19:549-553.

Haist SA, Lineberry MJ, Griffith CH, Hoellein AR, Talente, GM, Wilson JF. Sexual History Inquiry and HIV Counseling: Improving Clinical Skills and Medical Knowledge through an Interactive Workshop Utilizing Standardized Patients, Advances in Health Sciences Education. 2008; 13(4):427-434

Feddock CA, Hoellein AR, Griffith CH, Wilson JF, Lineberry MJ, Haist SA. Enhancing Knowledge and Clinical Skills Through an Adolescent Medicine Workshop. Arch Pediatr Adolesc Med. 2009;163(3):256-260.
Hoellein AR, Griffith CH, Lineberry MJ, Wilson JF, Haist SA. A Complementary and Alternative Medicine Workshop Using Standardized Patients Improves Knowledge and Clinical Skills of Medical Students. Alternative Therapies in Health and Medicine. Nov/Dec 2009.

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Griffith CH, Wilson JF, Langer S, Haist SA. Housestaff Nonverbal Communication Skills and Standardized Patient Satisfaction. J Gen Intern Med. 2003; 18: 170-174.
Duke MB, Griffith CH, Haist SA, Wilson JF. A Clinical Performance Exercise for Medicine-Pediatrics Residents Emphasizing Complex Ambulatory and Psychosocial Skills. Acad Med. 2001; 76: 1153-1157.

RICERCA AMBIENTALE E STUDI FAUNISTICI: Metodi non-cruenti

Per molti settori della ricerca zoologica attinenti ad aspetti di distribuzione, ecologia e conservazione delle specie, si ha la possibilità di ricorrere a metodi di indagine assolutamente incruenti per la fauna. In questa sede ne presentiamo alcuni.
– Ricerche eco-faunistiche: per le specie animali di medie-grandi dimensioni i metodi di ricerca in ambito faunistico non prevedono più l’uccisione dell’esemplare. I più recenti protocolli di studio, cattura e manipolazione dei grandi mammiferi [1] sono ottimi esempi di come si possa studiare la fauna in natura ingerendo il meno possibile nella biologia della specie che si sta indagando. Come non ricordare, d’altra parte, che le origini delle scienze – e nello specifico delle scienze naturali – sono nate e si sono sviluppate sulla pratica dell’osservazione e della non interferenza dell’osservatore nelle dinamiche osservate (a partire da Charles Darwin).

– Alcuni roditori, come gli Scoiattoli e i Ghiri, possono essere studiati utilizzando alcune trappole incruente costituite da tubi di plastica di idoneo diametro contenenti un’esca alimentare e contornati con scotch adesivo nella parte superiore: al passaggio forzato dell’animale nel tubo lo scotch raccoglierà alcuni peli che, una volta analizzati, testimonieranno il passaggio di quella specie. Si segnalano, in Italia, alcune recenti ricerche svolte sui micromammiferi in Umbria dal gruppo di A. Paci [2].

– Il metodo cosiddetto “naturalistico”, inoltre, fornisce dati utili sulla presenza della specie di interesse semplicemente raccogliendo sul campo peli, piume, escrementi, borre e carcasse od osservando impronte, tracce e altri segni indiretti.

– Un esempio dell’applicazione di questo metodo è dato dallo studio della fauna composta da
Mammiferi di piccole dimensioni, come arvicole, toporagni, ecc. mediante analisi delle borre di rapaci notturni. Nella dieta di barbagianni, civette e gufi, infatti, finiscono numerosi animali di difficile osservazione diretta e che è quindi possibile studiare in modo “indiretto” analizzando i frammenti di ossa e peli contenuti nei rigurgiti di questi rapaci. Questo vale anche per gli studi che coinvolgono invertebrati: è possibile utilizzare ad esempio la ricerca e l’utilizzo di esuvie (ciò che resta dell’insetto dopo la muta) e nicchi ormai vuoti, per il riconoscimento di insetti e lumache.

– l’uso di macrofotografie su soggetti viventi con cui si può giungere a costruire tabelle di riconoscimento dicotomiche efficaci e facilmente applicabili;

– La ricerca di microrganismi a fini epidemiologici può avvenire con il prelievo di materiale fecale attraverso tampone cloacale e la tempestiva tipizzazione batterica, seguendo procedure e tecniche standardizzate presso laboratori attrezzati [3] o con l’applicazione di opportuni trattamenti antielmintici in individui appositamente stabulati (Oneto et al., 2006).

– Altro esempio applicativo del metodo naturalistico, che evita catture e uccisioni, è quello legato agli studi di parassitologia, microbiologia e alimentazione effettuati attraverso l’esame delle carcasse di animali investiti su strada (Ferri e Soccini, 2001 e 2006; Nieddu et al., 1999).
• Nel caso in cui la specie si presti all’osservazione a distanza, possono essere utilizzati metodi che fanno uso delle moderne tecnologie audio-video, come l’analisi delle eco-localizzazioni per lo studio dei Chirotteri o dei Mammiferi marini (che emettono suoni a frequenze quasi sempre specie-specifiche e, quindi, identificabili “traducendo”, anche attraverso l’uso di particolari software per computer, il segnale sonoro), il riconoscimento dei canti degli Uccelli e degli Anfibi, l’emissione di canti pre-registrati per stimolare la risposta di eventuali individui presenti nella zona (come, ad esempio, nel wolfhowling per il monitoraggio del Lupo). In alcuni casi possono essere installate videocamere a controllo a distanza nei pressi dei siti di nidificazione e cova, per seguire in diretta le fasi riproduttive. Altri sistemi per valutare presenza/assenza di talune specie di medie-grandi dimensioni sono le prove fotografiche raccolte mediante apparecchi appositamente modificati per scattare nottetempo, al passaggio dell’animale, foto ravvicinate. In questo modo, collocando la macchina fotografica in un punto strategico (scelto in base alle conoscenze sull’ecologia della/e specie che stiamo studiando) e lasciandola in situ per uno o più giorni, si possono raccogliere numerosi dati di presenza: questo metodo è stato recentemente utilizzato, ad esempio, per confermare la presenza di specie rare e sfuggenti (come il Gatto selvatico o l’Orso bruno) in Appennino centrale (ad esempio nelle Marche il gruppo di lavoro di Paolo Forconi e Maurizio Fusari, dello Studio Chiros, ha accertato con questo metodo la presenza di un individuo erratico di Orso bruno nei Monti Sibillini nel mese di ottobre del 2006)

– Un discorso a parte meritano le indagini che prevedono la cattura dell’animale per il marcaggio di uno o più individui tramite microchip sottocutaneo, contrassegni applicati all’esterno (come le placche auricolari o la colorazione della pelliccia dell’animale) e piccoli trasmettitori dorsali destinati al telerilevamento (tecniche di radio-tracking) o all’osservazione a distanza di animali molto mobili o indistinguibili individualmente dalla livrea. In molti casi si è constatato che lo stress causato al momento della cattura e del rilascio, il peso degli apparecchi utilizzati, così come l’emissione di onde radio e l’infiltrazione di agenti patogeni nei siti di inserimento sottocutanei abbiano avuto un ruolo determinante sul tasso di mortalità e morbilità nei casi studiati.

– Per ora, comunque, non esiste un marcaggio perfetto, anche se alcune metodiche come il riconoscimento delle caratteristiche individuali morfologiche, di livrea o il pattern di colorazione, attraverso fotografie ravvicinate o l’utilizzo di microchips, inseriti in PIT tags (cioè passive integrated transponder, Biomark ® http://www.biomark.com) e iniettati sottocute o nei sacchi linfatici (Anfibi) con le necessarie attenzioni sanitarie, sembrano dare i migliori risultati (Keck, 1994; Buhlman e Tuberville, 1994; Elbin e Burger, 1994; Bernini, Barbieri e Vercesi, 2001).

– Cura del disegno sperimentale: nelle attività di monitoraggio e ricerca di piccoli animali che necessitano di metodi riferibili al “trappolaggio incruento” (raccolta di peli o cattura di animali mediante trappole che non provocano menomazioni o ferite né uccidono gli individui), uno dei fattori che incide pesantemente sul risultato finale dello studio e, soprattutto, sullo stato di salute degli esemplari catturati è il cosiddetto “sforzo di campionamento”, ovvero il tempo necessario per raccogliere dati esaustivi e attendibili. Più ampio sarà tale sforzo (commisurato alla biologia della/e specie che stiamo studiando), maggiori sono le probabilità che nessun animale trappolato subisca danni e migliore sarà anche il risultato finale. In questi studi è molto importante, dunque, definire a priori il posizionamento delle trappole e la relativa tempistica prevista per il monitoraggio delle stesse.

– Ricerche genetiche: con i progressi delle tecniche di biologia molecolare e la loro sempre maggiore affidabilità/affinità delle moderne tecnologie in uso nei laboratori di genetica oggi nella maggior parte dei casi è sufficiente raccogliere un piccolo campione biologico per poter procedere con le specifiche analisi e portare a termine ricerche genetiche che fino a poco tempo fa non erano neppure concepibili senza la morte di uno o più animali.

– Segnaliamo, ad esempio, il metodo messo a punto per il riconoscimento specie-specifico dei
Mammiferi Mustelidi (come faina, martora, puzzola), elaborato dall’Università degli Studi di Perugia [4], che si basa sull’analisi del DNA contenuto in peli o escrementi raccolti sul campo e che permett
e di riconoscere non solo la specie, ma – una volta acquisiti più dati relativi ad una certa zona – anche il singolo individuo e il grado di parentela con gli altri individui della stessa specie.

– Per quanto riguarda l’identificazione di infezioni portate da microrganismi patogeni (come funghi, batteri e virus) la ricerca biomolecolare ha fatto buoni passi in avanti e in molti casi è oggi possibile verificare la presenza dell’agente infettante senza dover necessariamente uccidere l’esemplare esaminato. Un valido esempio è dato dalla recente applicazione delle tecniche di biologia molecolare come strumento diagnostico per la ricerca del pericoloso fungo Batrachochytrium dendrobatidis che colpisce mortalmente alcune specie di Anfibi.

– Oltre alla caratterizzazione istologica che obbliga alla disponibilità di tessuti prelevati spesso da individui viventi (come falangi delle dita, parti dell’epidermide ventrale, astuccio corneificato dell’apparato boccale delle larve), la diagnosi può infatti avvenire con l’uso di due tecniche meno invasive: la caratterizzazione genica [5] e quella immunoistochimica [6].

– Un gruppo di ricercatori australiani [7], poi, è riuscito a mettere a punto un test quantitativo che permette di indicare il livello dell’infezione di un animale potendo rilevare anche una sola zoospora del fungo in ciascun campione analizzato, senza procurare lesioni o tagli all’animale perché si agisce semplicemente sfregando un tampone sulla pelle dell’anfibio [8].

Note e riferimenti:
[1] Citiamo, ad esempio, il “Piano d’azione nazionale per la conservazione del Lupo (Canis lupus)” il “Piano d’azione nazionale per il Camoscio appenninico (Rupricapra pyrenaica ornata)”, curati dal Ministero dell’Ambiente e dall’Istituto Nazionale della Fauna Selvatica.

[2] Gaggi A. & Paci A.M., 2003. Micromammiferi dei Piani Carsici di Colfiorito (Perugia –
Macerata). Hystrix, It. J. Mamm. (n.s.) suppl.: 119-120;

Paci A.M., Romano C. & Palanga S., 2003. Micromammiferi del Parco regionale di Monte Cucco (Perugia). Hystrix, It. J. Mamm. (n.s.) suppl.: 129-130

[3] Ferri V. & C. Soccini, 2005. Nuovi habitat per Rana latastei nel S.I.C. di Monticchie
(IT2090001, Somaglia, Lodi). Comunicazione al PPP05 – Pond, Puddles and Pools
(Trieste, 20-21 giugno 2005)

[4] Vercillo F., Lucentini L., Palomba A., Panara F. & Ragni B., 2005. Riconoscimento specie-specifico di Mustelidi mediante analisi biomolecolare applicata a indici di presenza indiretta. 66° Congresso UZI, Roma. Programma, Riassunti

[5] Tecnica di biologia molecolare che sfrutta la Reazione a Catena della Polimerasi (PCR) come strumento diagnostico. Dopo l’estrazione del DNA totale dell’individuo, effettuata anche soltanto con un minimo prelievo di sangue, è possibile rilevare la presenza dell’organismo patogeno mediante l’utilizzo di sequenze oligonucleotidiche (primers) altamente specifiche.

[6] Questa tecnica si avvale alla disponibilità di anticorpi policlonali per test di immunolocalizzazione: i campioni conservati di individui già morti per cause naturali o per la possibile infezione, vengono sottoposti a queste particolari colorazioni che nel caso di effettiva infezione mettono in evidenza in modo inequivocabile l’avvenuta reazione.

[7] Ricercatori del CSIRO, Australian Animal Health Laboratory (http://www.csiro.au/)

[8] Citiamo, tra gli altri:
Boyle DG, Boyle DB, Olsen V, Morgan JA, Hyatt AD. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Dis Aquat Organ. 2004 Aug 9;60(2):141-8.

Mini-approfondimento sui metodi in silico SAR e QSAR

SAR e QSAR sono gli acronimi rispettivamente di “relazione struttura-attività” e “relazione quantitativa strutture – attività”: si tratta di modelli in grado di predire i possibili effetti di una sostanza sull’organismo confrontandola con sostanze strutturalmente simili di cui sono già noti gli effetti. I modelli QSAR sono descrizioni matematiche delle relazioni intercorrenti fra le proprietà fisico-chimiche delle molecole e la loro attività biologica. Per costruire un modello QSAR si seleziona un gruppo di sostanze sulla base della similitudine per struttura e meccanismo di azione biologica e all’interno della classe si selezionano alcune sostanze rappresentative. Dopodichè si descrivono le caratteristiche strutturali della sostanza (p.e.: solubilità in acqua, punto di fusione, punto di ebollizione, densità, indice di rifrazione, potenziale di ionizzazione, etc.). Si effettua poi un’analisi che evidenzia alcune caratteristiche comuni tra le sostanze. Si costruisce infine il modello QSAR, che mette in relazioni le caratteristiche chimiche con gli effetti biologici che si reperiscono in letteratura.
Sono modelli QSAR, già diffusamente impiegati dall’industria, il DereK, TopKat e CASE, per lo studio della sensibilizzazione cutanea , mutagenesi e cancerogenesi, tossicità cronica delle sostanze chimiche. Molti altri sono utilizzati o in via di sviluppo.

[Adattato dal dossier LAV 2007 “Un’altra ricerca è possibile – Metodi sostitutivi alla sperimentazione animale”: http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf]

Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte II

SPERIMENTAZIONE SUI FARMACI

– Vedi parte riguardante i “test di tossicità” (http://alternativesperimentazioneanimale.wordpress.com/2013/01/26/mini-dossier-sui-metodi-alternativi-parte-i/)

– Metodi in silico: sono diverse le industrie che di routine impiegano tali metodi per lo studio degli effetti delle sostanze chimiche sulla pelle e per le proprietà cancerogene (Derek, Deductive Estimation of Risk from Existing Knowledge, per mutagenesi, cancerogenesi, sensibilizzazione cutanea; Topkat, Toxicity Prediction by Komputer Assisted Technology, per sensiblizzazione cutanea; CASE, Computer Automated Strucuture Evaluation, per sensiblizzazione cutanea); MultiCASE, META, CASETox e Toxalert per studi di tossicità ed ecotossicità.

Molti altri modelli QSAR sono stati sviluppati specificatamente per la ricerca e sviluppo di farmaci, di seguito alcuni esempi:
– Amedis, UK ha sviluppato un modello per i test di cancerogenesi che offre risultati migliori
dell’AMES test.

– Alla Pennsylvania State University è stato messo a punto un modello di stomaco virtuale che
ricrea elementi come il movimento gastrico, la dissoluzione di compresse, e serve a predire il destino del farmaco nel suo passaggio gastrico.[1]

– Tripos’ Volsurf [2] calcola le proprietà correlate all’ADME basandosi sulle interazioni a livello tridimensionale della molecola ed è stato messo a punto partendo da dati di ADME in vitro.

– CombinatoRx, oggi Zalicus, mette a punto modelli in grado di analizzare l’interazione di più farmaci utilizzati contemporaneamente.

– Compudrug (www.compudrug.com) ha sviluppato diversi sistemi per la ricerca in ambito farmaceutico, biotecnologico: HazardExpert è un sistema di predizione che, usato insieme a
MetabolExpert fornisce informazioni sul metabolismo sia del composto iniziale che dei suoi derivati (metaboliti).

– Test in vitro: vedi la parte I del dossier (esclusi biocompatibilità ed ecotossicità).
Nella ricerca farmaceutica inoltre ci sono metodi più avanzati, sebbene alcuni in fase di sviluppo, come gli organi bioartificiali. La Advanced Tissue Sciences Inc., sfrutta questa tecnologia inserendo cellule umane in un bioreattore, un contenitore con temperatura, umidità e altri fattori uguali a quelli del corpo umano. Anche in Italia viene eseguita questo tipo di ricerca, ad esempio, presso l’università della Calabria e l’Università di Pisa, in cui si studiano rispettivamente modelli bioartificiali di fegato e di intestino umani.

– LION Bioscience utilizza il sistema IDEA (in vitro Determination for the Estimation of ADME). Esso è costituito da un modello statistico che predice la permeabilità intestinale di una molecola; da un secondo modello statistico che predice l’assorbimento a partire da caratteristiche strutturali della molecola e da un modello fisiologico dell’assorbimento orale, basato sull’analisi di dati provenienti da test in vitro, dati clinici e caratteristiche chimiche della molecola [3].

– Farmacogenomica
Oggi, la ricerca farmaceutica è volta sempre di più a disegnare farmaci “su misura”, visto che individui diversi possono rispondere alla somministrazione di un medicinale in modo diverso dato il loro profilo genetico. La scienza che studia le relazioni tra farmaci e genoma è la Farmacogenomica. Questi studi sono possibili grazie all’osservazione clinica unitamente alla ricerca genetica e molecolare umana in relazione all’effetto dei farmaci. Lo sviluppo di questa scienza, analogamente alla Tossicogenomica, porterà alla produzione di farmaci più sicuri [4].
Le tecnologie impiegate nella farmacogenomica sono simili a quelle della tossicogenomica: DNA-chip, chiamato anche DNA-microarray, è un vetrino su cui sono inseriti, in apposite micro nicchie di 200 nanometri di diametro (1 nanometro è pari a un milionesimo di millimetro), circa 500.000 filamenti di DNA.
Il suo funzionamento è basato sulla capacità dei geni attivi di una cellula di legarsi ai loro complementari presenti sul vetrino: in questo modo è possibile analizzare porzioni di DNA e riconoscere quali geni sono attivi nel campione biologico. Questo principio è applicabile sia allo studio dei farmaci sia alla ricerca di base, poiché consente di analizzare in poco tempo grandi porzioni di genoma [5].

– La Biologic Inc, California, produce il Phenotype Microarrays (http://spinoff.nasa.gov/Spinoff2005/hm_2.html), che serve a controllare molte funzioni cellulari in base al farmaco cui vengono esposte.

– Cellule coltivate in microchip: il metodo è stato sviluppato dalla Hurel Corporation (http://www.hurelcorp.com). Esso consiste in un microchip a compartimenti, ognuno dei quali ospita cellule diverse (intestino, fegato, reni, cuore, etc). È un modello del metabolismo del farmaco, i cui studi di validazione hanno dimostrato la sua efficacia nel predire il metabolismo dei farmaci meglio dei test su animali e addirittura di prove cliniche [6].

Studi clinici:
– Prima di effettuare prove su volontari esistono software di simulazione per uno studio clinico preliminare, come quello messo a punto da Pharsight (http://www.pharsight.com/main.php).

– Microdosing: consiste nel somministrare bassissime quantità del farmaco da testare e poi eseguire periodicamente delle analisi su sangue e urine dei volontari sottoposti alla sperimentazione per verificare se, come e dove la sostanza è stata trasformata, espulsa o accumulata e per le sue caratteristiche non presenta rischi di effetti collaterali [7]. La novità del microdosing è che la sostanza viene somministrata a dosi dell’ordine di circa 1000 volte inferiori alla dose che potrebbe causare effetti avversi. Oggi è possibile fare questo grazie alle moderne tecniche di analisi chimiche, che consentono di rintracciare in sangue e urine anche piccolissime quantità della sostanza in esame [8] con tecniche di analisi chimica avanzate come la AMS
(Spettrometria di Massa con Acceleratore). Eventualmente, il percorso del farmaco può essere seguito nell’organismo grazie a tecniche di immagine, come la PET: il farmaco viene “marcato” con atomi radioattivi che possono essere seguiti dal macchinario.

– La società inglese Pharmagene impiega esclusivamente cellule e tessuti umani per la ricerca farmaceutica, convinti che sia l’unico modo per sviluppare farmaci efficaci e sicuri. Di recente si è fusa con Asterand, specializzata nella conservazione e distribuzione di tessuti e cellule umane (http://www.asterand.com/Asterand/).

Riferimenti:
[1] Pal A, Indireshkumar K, Schwizer W, Abrahamsson B, Fried M, Brasseur JG. Gastric flow and mixing studied using computer simulation. Proc Biol Sci. 2004 Dec 22;271(1557):2587-94.

[2] Cianchetta, G.; Mannhold, R.; Cruciani, G.; Baroni, M.; Cecchetti, V. “Chemometric studies on  the bactericidal activity of quinolones via an extended VolSurf approach.” J. Med. Chem. 2004, 47, (12) 3193-3201.

Ecker, G. F.; Noe, C. R. “In silico prediction models for blood-brain barrier permeation.”
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Staerk, D.; Skole, B.; Jorgensen, F. S.; Budnik, B. A.; Ekpe, P.; Jaroszewski, J. W. “Isolation of
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[3] http://www.admemodel.com/

[4] FIORGEN Fondazione Farmacogenomica. Polo Scientifico – 50019 Sesto Fiorentino (Firenze) Via Luigi Sacconi, 6
http://www.fiorgen.net/ricerca.htm

[5] Villeneuve DJ, Parissenti AM. The use of DNA microarrays to investigate the pharmacogenomics of drug response in living systems. Villeneuve DJ, Parissenti AM.

Meloni R, Khalfallah O, Biguet NF. DNA microarrays and pharmacogenomics. Pharmacol Res. 2004 Apr;49(4):303-8.

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[7] European Medicines Agency (2004) Position paper on non-clinical safety studies to support clinical trials with a single microdose. CPMP/SWP/2599/02/Rev1.
(http://www.ema.europa.eu/docs/en_GB/document_library/Scientific_guideline/2009/09/WC500002720.pdf)

[8] Rowald M. Microdosing and the 3Rs. Publication from National Centre for the Replacement, Refinement and Reduction of animals in research. 2006:1–7. NC3Rs #5.

P. Usha Rani and M. U. R. Naidu. Phase 0 – Microdosing strategy in clinical trials. Indian J Pharmacol. 2008 Nov-Dec; 40(6): 240–242.

SPERIMENTAZIONE SUI VACCINI

Dopo aver isolato ed identificato l’agente patogeno, si procede con i seguenti passaggi:

– sequenziamento del genoma dell’agente patogeno con tecniche di biologia molecolare;

– selezione delle proteine del patogeno con proprietà di stimolazione della risposta immunitaria: per eseguire questo passaggio si impiegano modelli informatici (in silico): analogamente ai modelli QSAR, ci sono modelli in grado di predire il potere immunogeno di una proteina sulla base della conoscenza del potere immunogeno di proteine note *. Oggi ci sono banche che custodiscono le sequenze geniche di centinaia di batteri, funghi e virus patogeni. Alcuni modelli in silico disponibili sono:
EpiMer, EpiMatrix, Conservatrix, BlastiMer, Patent-Blast**, Immunogrid (progetto italiano);

– produzione in vitro delle proteine selezionate;
– test di tossicità: vedi parte I del dossier;

potency test (per verificare l’efficacia del vaccino): si misura con metodi chimico analitici la quantità di antigene presente.
Nel 1997 la Farmacopea Europea non ha richiesto l’esecuzione di test su animali per il potency test su vaccino antidifterite, tetano e pertosse, risparmiando così la vita a 35.000 animali ogni anno. È plausibile che man mano questa decisione verrà estesa anche ad altri vaccini.

Riferimenti:
* Surajit Ray and Thomas B Kepler. Amino acid biophysical properties in the statistical prediction of peptide-MHC class I binding. Immunome Res. 2007; 3: 9.
** De Groot AS, Bosma A, Chinai N, Frost J, Jesdale BM, Gonzalez MA, Martin W, Saint-Aubin C. From genome to vaccine: in silico predictions, ex vivo verification. Vaccine. 2001 Aug 14;19(31):4385-95.

ANALISI SU ALIMENTI E NELLA DIAGNOSI

La tendenza attuale è quella di ricorrere all’analisi chimica. Con la chimica analitica è necessario conoscere la molecola che si intende rintracciare per poi verificarne la presenza e la quantità nel campione.
L’Istituto Zooprofilattico di Lazio e Toscana è un esempio di come, negli ultimi anni si stia sempre di più ricorrendo all’uso di metodi analitici e saggi in vitro per le verifiche igienico sanitarie su alimenti per la diagnosi. Molti dei test prima eseguiti su animali si stanno sostituendo con altre metodiche. Si riporta di seguito il caso esemplificativo delle biotossine algali.

Le biotossine algali sono molecole prodotte da alcune specie di alghe che rivestono interesse sanitario in quanto contaminanti alimentari, in particola
re di molluschi bivalvi (cozze, vongole, etc).
Il Ministero della Salute opera un monitoraggio sui molluschi per rintracciare la presenza di biotossine algali attraverso gli Istituti Zooprofilattici che effettuano analisi per il controllo dell’igiene degli alimenti (Decreto del 16 maggio 2002).
Il test di riferimento indicato per rintracciare la presenza di biotossine in estratti di molluschi prevede l’impiego di topi o ratti. Più spesso viene impiegato il topo, attraverso il saggio MBA (Mouse Bio Assay), che prevede l’impiego di tre topi o tre ratti (in questo caso trattasi di Rat Bio Assay) cui viene iniettato intraperitonealmente (nella cavità addominale) il campione da testare. Si valuta la comparsa di reazione diarrogena o la morte entro un tempo definito; i sintomi osservabili sono comunque vari: prostrazione, ipotermia, tachicardia.
Le tossine sono classificate in 8 gruppi in base alla loro struttura chimica e in tre gruppi in base alla loro attività tossica: PSP (Paralytic Shellfish Poison), ASP (Amnesic Shellfish Poison) e DSP (Diarrhoeic Shellfish Poison). Gli effetti possono spaziare dal mal di testa alla diarrea e persino alla morte.

Metodi sostitutivi:
Per la determinazione delle tossine ASP non si ricorre più all’impiego di animali: a livello internazionale è riconosciuto e accettato il metodo chimico analitico; si continuano invece ad utilizzare animali per rintracciare le tossine PSP e DSP (Capitolo V dell’allegato alla direttiva 91/492/EEC).

Metodi disponibili:
metodi chimico – analitici:
cromatografia liquida ad alto rendimento (HPLC con determinazione fluorimetrica, la cromatografia su strato sottile (TLC)
spettrometria di massa (MS)

metodi biochimici e in vitro:
test di inibizione della fosfatasi
test di citotossicità
immunosaggi (sebbene per eseguire questi siano impiegati anticorpi prodotti utilizzando animali)

Un report dell’Istituto tedesco per la valutazione del rischio (Position Paper Nr. 013/2005 of the BfR of April 07, 2005) riporta che la Germania non ricorre più all’impiego di animali per rintracciare biotossine algali dal 1980, avvalendosi esclusivamente di metodi di analisi chimica. L’analisi chimica è un approccio rigoroso e scientifico rispetto all’impiego di animali poiché fornisce un dato certo della presenza della tossina nei molluschi e della loro quantità. Gli esperti tedeschi dichiarano che il metodo chimico analitico offre affidabilità e sicurezza del metodo, oltre al vantaggio di non comportare sofferenza e uccisione di alcun animale.
Sono disponibili anche metodi in vitro basati su colture cellulari e sistemi che si basano sull’interazione tra tossine e recettori sulla superficie cellulare; oppure si sfrutta l‘effetto delle biotossine di modificare la differenza di potenziale delle membrane cellulari; oppure il loro effetto inibitorio su alcuni enzimi.
Questi sono i metodi in fase di studio per le tossine DSP: studi di prevalidazione hanno dati risultati incoraggianti.
Altri metodi sono quelli immunologici, che sfruttano il legame con anticorpi, utili se la tossina da rintracciare è una e nota; altrimenti può essere utile come metodo di conferma. Diversi progetti sono in corso per migliorare questi test e renderli ufficiali.

PRODUZIONE DI ANTICORPI

Da circa dieci anni è già possibile sostituire l’uso di animali nella fase di produzione, ricorrendo alla propagazione dell’anticorpo in vitro. La produzione in vitro è fortemente consigliata da parte di ECVAM (European Center for the Validation of Alternative Methods) già dal 1998*. Eppure ancora si fa uso di animali, nonostante la loro sostituzione sia già praticabile, almeno nella fase di produzione.
Più recentemente è stata messa a punto una tecnologia in grado di sostituire completamente il ricorso ad animali, anche nelle prime fasi di immunizzazione. Si tratta delle cosiddette “librerie fagiche”: un metodo di ingegneria genetica che sfrutta dei particolari virus detti fagi (si tratta di virus che infettano batteri) per clonare i geni che esprimono gli anticorpi e modificando i geni è possibile ottenere anticorpi diversi adattabili a qualsiasi antigene**. La tecnica delle librerie fagiche offre anche vantaggi di rapidità e costi contenuti.

Riferimenti:
* Peterson NC, Peavey JE. Comparison of In Vitro Monoclonal Antibody Production Methods with an In Vivo Ascites Production Technique. Contemp Top Lab Anim Sci. 1998 Sep;37(5):61-66.

Proceedings of the Production of Monoclonal Antibodies Workshop. Aug. 1999. Edited by J. E. McArdle and C J. Lund. Alternatives Research and Development Foundation.

http://altweb.jhsph.edu/mabs/ardf/hendriksen.htm
http://altweb.jhsph.edu/mabs/ardf/mcardle.html

** Flego M, Ascione A, Pini A, Mennella V, Dupuis ML, Benagiano G, Cianfriglia M. [Use of phage libraries for the in vitro production of recombinant monoclonal antibodies of predetermined specificity]. Ann Ist Super Sanita. 2002;38(4):401-10.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12760337

Mini-dossier sui Metodi Alternativi: parte I

Questo mini-dossier nasce come risposta a tutti coloro che chiedono “se non sperimentiamo sugli animali, cosa dovremmo fare?”

Sappiamo benissimo che un singolo metodo non può sostituire un organismo intero, ma il modello animale, anche se è un organismo intero, ci fornisce dati irrilevanti. Un insieme di tecniche basate su dati specie-specifici ci fornisce dati rilevanti per l’umano, e, sebbene non costituiscano un organismo completo, utilizzati in maniera integrata possono avvicinarsi alla complessità umana molto meglio dell’animale [1,2,3,4].

Non faremo distinzione tra metodi validati e non validati, dato che l’attuale metodo di validazione prevede il confronto con i dati forniti dall’animale – che non è predittivo – il che non ci permette di valutare la reale efficacia di una o più metodologie integrate.

In questo senso, criticando il modello animale quale gold standard, bisogna per forza di cose criticare un metodo di validazione che si basa su di esso.
Non a caso, nella sostituzione del Draize Test, c’è stata necessità di rieffettuare una validazione, non per colpa dei metodi sostitutivi, ma per i falsi positivi che il Draize test tendeva a dare [5].

Infatti il Cytosensor Microphysiometer, che doveva rimpiazzare il Draize Test, diede un risultato inizialmente inconcludente, dato che si confrontò il suo risultato con quello del Draize test stesso, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive [6].

Infine, vogliamo avvisare i lettori che questo è l’adattamento di un dossier LAV del 2007 (http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf), pertanto non è aggiornato e non è quindi esaustivo.

Riferimenti:

[1] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Cell Tissue Bank. 2011 Feb;12(1):31-2. doi: 10.1007/s10561-010-9213-5. Epub 2010 Sep 8.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20824349

[2] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Altern Lab Anim. 2010 Dec;38 Suppl 1:27-30.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21275480

[3] Hillier C, Bunton D. Could fresh human tissues play a key role in drug development? Altern Lab Anim. 2009 Sep;37 Suppl 1:5-10.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19807198

[4] Hillier C, Bunton D. Functional human tissue assays. Drug Discov Today. 2007 May;12(9-10):382-8. Epub 2007 Apr 5. 
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17467574

[5] Alan M. Goldberg, Thomas Hartung, “Protecting more than animals”, Scientific American, January 2006

[6] Hartung T, Bruner L, Curren R, Eskes C, Goldberg A, McNamee P, Scott L, Zuang V. First alternative method validated by a retrospective weight-of-evidence approach to replace the Draize eye test for the identification of non-irritant substances for a defined applicability domain. ALTEX. 2010;27(1):43-51. 
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20390238

 

TOSSICITA’ ACUTA:

Il progetto sulla tossicità acuta “ACuteTox”, conclusosi nel 2010, prevede il ricorso a metodi in vitro e lo studio di tutti i dati già disponibili in natura sulla tossicità acuta.*

Inoltre, sarebbe teoricamente possibile beneficiare di tutti i dati già disponibili custoditi ad esempio in centri antiveleni, ospedali e industrie, che hanno il vantaggio di offrire dati sulla tossicità umana. Su questi dati è ipotizzabile effettuare uno studio con metodi QSAR e screening in vitro con i saggi già in uso su colture cellulari.

* Riferimenti:

C. Clemedson, B. Blaauboer, J. Castell, R. Clothier, S. Coecke, T. Cole, A. Forsby, M. J. Gómez- Lechón, A. Kinsner-Ovaskainen, J. E. O’ Connor, M. P. Ryan, M. Sjöström and J. A. Vericat. Overview of the ACuteTox project and multivariate analysis of the in vitro data. VII World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. Roma (Italy), August 30- September 3, 2009. Oral presentation. ALTEX, 26 (Spec. Issue) 1-376 (2009) pp 269.

Kopp-Schneider A. Statistical analysis of the ACuteTox data: challenges and statistical approaches. VII World Congress on Alternatives & Animal Use in the Life Sciences. Roma (Italy), August 30- September 3, 2009. Oral presentation. ALTEX, 26 (Spec. Issue) 1-376 (2009) pp 269-270.

 

FULL TEXT: http://www.altex.ch/resources/theme3.pdf

IRRITAZIONE OCULARE*

– Uno studio accurato della sostanza da un punto di vista chimico fisico consente di effettuare una prima scrematura. Ad esempio, sostanze con pH altamente acido o altamente alcalino sono sicuramente irritanti e quindi non dovrebbero necessitare di alcun altro test;

– Analisi statistica dei dati già disponibili in letteratura per verificare se sono disponibili dati di una sostanza strutturalmente simile che potrebbe presentare effetti analoghi, valutabili con metodi QSAR

– Modelli di cornea umana in vitro:

1) saggio EpiOcular** (prodotto da MatTek, USA): è costituito da cellule di epidermide umana cresciuta su un terreno privo di derivati animali, su particolari supporti in modo che si formi una struttura multistrato che simula l’anatomia dell’epitelio della cornea. Il test consiste nel misurare, con appositi saggi, il grado di danneggiamento delle cellule da parte della sostanza in esame. È utile per misurare gradi di irritazione da leggeri a moderati, mentre non è predittivo per sostanze a sospetto alto potere irritante. Già utilizzato da alcune industrie.

2) modello HCE*** (prodotto da SkinEthic, Francia): si tratta di una ricostruzione di epitelio di cornea umana ricostituito in vitro a partire da cellule fatte crescere su un substrato di policarbonato. Già in uso da alcune industrie.

3) Modello HCE – T (prodotto da Gillette Corporation, USA): è un modello costituito da cellule di epitelio di cornea umana fatte crescere su un substrato di collagene. È stato validato da ECVAM; è utilizzabile solo per certe tipologie di liquidi.

4) Metodo IRRITECTION****: è un modello in vitro integrato con un software, utilizzabile anche per il test di irritazione cutanea. La struttura base di questo modello è una proteina di grandi dimensioni, che insieme ad altri componenti forma una matrice trasparente simile alla cornea umana. L’azione irritante di una sostanza ha l’effetto di opacizzare la struttura e l’opacizzazione viene misurata: maggiore è l’opacizzazione, maggiore è il potere irritante.

 Riferimenti:

* Alternative (non Animal) Methods for Cosmetics Testing: Current Status and Future Prospects. Edited by C. Eskes e V. Zuang; ATLA, Vol. 33, luglio 2005.
FULL TEXT: http://www.frame.org.uk/atla_issue.php?iss_id=15

** Stern M, Klausner M, Alvarado R, Renskers K, Dickens M. Evaluation of the EpiOcular((TM)) Tissue Model as an Alternative to the Draize Eye Irritation Test. Toxicol In Vitro. 1998 Aug;12(4):455-61.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20654428

*** Cotovio J, Grandidier MH, Lelièvre D, Bremond C, Amsellem C, Maloug S, Ovigne JM, Loisel-Joubert S, Lee AV, Minondo AM, Capallere C, Bertino B, Alépée N, Tinois-Tessonneaud E, de Fraissinette Ade B, Meunier JR, Leclaire J. In vitro assessment of eye irritancy using the Reconstructed Human Corneal Epithelial SkinEthic HCE model: application to 435 substances from consumer products industry.

Toxicol In Vitro. 2010 Mar;24(2):523-3
7. doi: 10.1016/j.tiv.2009.11.010. Epub 2009 Nov 12.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19913609

**** http://www.invitrointl.com/products/irritect.htm

IRRITAZIONE CUTANEA

– Irritection test (vedi Irritazione Cutanea)

– EpiDerm*

– EpiSKIN*

Riferimenti:
* Faller C, Bracher M, Dami N, Roguet R. Predictive ability of reconstructed human epidermis equivalents for the assessment of skin irritation of cosmetics. Toxicol In Vitro. 2002 Oct;16(5):557-72.

CORROSIONE CUTANEA

Questo saggio viene eseguito per valutare la capacità corrosive di una sostanza sulla pelle; per eseguire questo test sono oggi disponibili tre kit commerciali di pelle ricostituita in sostituzione degli animali.

– Epiderm* consiste in frammenti di tessuto epidermico che devono essere conservati in frigorifero prima dell’uso; i pezzi vengono trattati con la sostanza da testare ed in seguito si misura il livello di corrosione attraverso la misura della riduzione dell’attività di un enzima vitale.

– Episkin** è un modello tridimensionale di pelle umana compreso di strato corneo; il funzionamento è analogo al metodo Epiderm.

– Corrositex* è una matrice di collagene ricostituito su cui viene posta la sostanza da testare; l’effetto viene misurato osservando la variazione di un colorante. Maggiore è il tempo necessario perché si verifichi la reazione, minore è l’effetto corrosivo della sostanza

Riferimenti:

* Wilson, D.M., McMullin, T.T. Kan, H.L., Golden, R.M. Stott, W.T. Dow Chemical, Midland, MI, USA. COMPARISON OF CORROSITEX AND EPIDERM™ IN VITRO SKIN CORROSION SCREENING ASSAYS TO IN VIVO CORROSIVITY RESULTS. Society of Toxicology 46th Annual Meeting, Charlotte, NC, (2007). The Toxicologist, 96, 1, 144 (2007).
(http://www.toxicology.org/AI/PUB/Tox/2007Tox.pdf)

** Netzlaff F, Lehr CM, Wertz PW, Schaefer UF. The human epidermis models EpiSkin, SkinEthic and EpiDerm: an evaluation of morphology and their suitability for testing phototoxicity, irritancy, corrosivity, and substance transport. Eur J Pharm Biopharm. 2005 Jul;60(2):167-78.

SENSIBILIZZAZIONE CUTANEA

– Modello informatico DEREK*, già utilizzato da molte industrie. Tali modelli consentono di predire la reazione immunitaria sulla base delle caratteristiche strutturali della sostanza da testare.

– Strategia integrata: test su linfociti umani coltivati in vitro seguita da valutazione su pelle umana ricostituita in vitro. Sono state coltivate diverse cellule della pelle umana che hanno un ruolo nella riposta immunitaria.

– Test su volontari: molto diffuso è il ricorso al cosiddetto “patch test”, che consiste nell’applicare sulla pelle di volontari un cerotto contenente la sostanza in esame per periodi di tempo e frequenze di applicazioni variabili.
Patch test utilizzati: Schwartz – Peck Test**; Human Repeated Insult Patch Tests (HRIPTs)***, Human Maximisation test (HMT)****.

– Test su espianti di pelle: sono stati condotti test su espianti di pelle umana (materiale di scarto proveniente da interventi chirurgici).

Riferimenti:

* Barratt MD, Langowski JJ. Validation and subsequent development of the DEREK skin sensitization rulebase by analysis of the BgVV list of contact allergens. J Chem Inf Comput Sci. 1999 Mar-Apr;39(2):294-8.

** Schwartz L (1951) The skin testing of new chemicals. J Soc Cosmet Chem 2:321-4.

Schwartz L (1969) Twenty-two years’ experience in the performance of 200,000 prophetic patch tests. South Med J 53:478-84.

Schwartz L, Peck SM (1944) The patch test in contact dermatitis. Public Health Rep 59: 546-57.

*** Draize JH, Woodard G, Calvery HD (1944) Methods for the study of irritation and toxicology of substances applied topically to the skin and mucous membrane. J Pharmacol Exp Ther 83: 377-90.

Draize JH (1959) Dermal toxicity. Appraisal of the safety of chemicals in foods, drugs and cosmetics. Association of food and drug officials of the United States, Texas State Department of Health. Texas: Austin.

Shelanski HA (1951) Experience with and considerations of the human patch test method. J Soc Cosmet Chem 2:324-31.

Shelanski HA, Shelanski WV (1953) A new technique of human patch tests. Proc Sci Sekt Toilet Goods Assoc 19:46-9.

**** Kligman AM (1966) The identification of contact allergens by human assay. III. The Maximisation Test: a procedure for screening and rating contact sensitisers. J Invest Dermatol 47:393-409.

(Ulteriori informazioni: http://ec.europa.eu/health/scientific_committees/consumer_safety/opinions/sccnfp_opinions_97_04/sccp_out102_en.htm )

ASSORBIMENTO CUTANEO

Questo test viene eseguito su campioni di pelle (il protocollo di questo test è indicato nelle linea guida OECD 428, che consiglia l’uso di pelle suina o umana) su cui viene posta la sostanza da testare e di cui si valuta l’assorbimento valutando il passaggio della sostanza dalla camera superiore a quella inferiore (figura). Il tempo di esposizione può variare a seconda che la sostanza sia destinata a permanere a contatto con la pelle (creme) o ad essere sciacquata via (saponi).

FOTOTOSSICITÀ

Questo test mira a valutare i possibili effetti di una sostanza chimica sulla pelle nel momento in cui essa è esposta alle radiazioni solari, come accade ad esempio per creme per il viso, ma soprattutto creme e stick per labbra solari. Oggi sono disponibili test in vitro che eliminano il ricorso ad animali, molto simili al test di assorbimento cutaneo (vedi sopra), al quale si unisce però l’osservazione degli effetti in seguito ad esposizione a raggi UV:

– 3T3 NRU Phototoxicity (96-well cell-based assay)*

– 3-D Reconstructed Human Epidermis Phototoxicity**

Il primo può essere usato per testare gli ingredienti, il secondo è usato per testare le formulazioni in un modello di esposizione della pelle.

Riferimenti:

* Ceridono M, Tellner P, Bauer D, Barroso J, Alépée N, Corvi R, De Smedt A, Fellows MD, Gibbs NK, Heisler E, Jacobs A, Jirova D, Jones D, Kandárová H, Kasper P, Akunda JK, Krul C, Learn D, Liebsch M, Lynch AM, Muster W, Nakamura K, Nash JF, Pfannenbecker U, Phillips G, Robles C, Rogiers V, Van De Water F, Liminga UW, Vohr HW, Wattrelos O, Woods J, Zuang V, Kreysa J, Wilcox P. The 3T3 neutral red uptake phototoxicity test: practical experience and implications for phototoxicity testing–the report of an ECVAM-EFPIA workshop. Regul Toxicol Pharmacol. 2012 Aug;63(3):480-8. doi: 10.1016/j.yrtph.2012.06.001. Epub 2012 Jun 9.

** http://www.iivs.org/scientific-services/laboratory-services/phototoxicity/3-d-phototoxicity/

TOSSICITÀ SUBACUTA E SUBCRONICA

Gli studi di tossicità cronica servono a predire scenari di esposizione ad una sostanza per tempi
lunghi. È il caso, ad esempio, di additivi alimentari, che possono essere ingeriti quotidianamente in piccole quantità. È necessario investigare gli effetti della sostanza a livello di quegli organi in cui è probabile che la sostanza man mano si accumuli e svolga i suoi effetti: fegato, reni, sistema nervoso centrale, polmoni e midollo.

Per soddisfare richieste così complesse è auspicabile il ricorso a sistemi integrati di metodi in vitro e in silico (modelli QSAR):

– Modello QSAR TOPKAT (http://accelrys.com/mini/toxicology/predictive-functionality.html), realizzato proprio per studiare il metabolismo di sostanze chimiche. È già in uso sebbene non possa essere impiegato ai fini legislativi perchè non ancora ufficialmente validato.

– Test in vitro: i saggi in questi test devono poter essere mantenuti per diversi giorni, difficoltà che limita il ricorso all’impiego di colture cellulari. Sono in corso diversi studi volti ad individuare le linee cellulari più adatte allo scopo. A seconda dell’organo bersaglio sono disponibili:

• fegato: esistono difficoltà tecniche al mantenimento per lunghi periodi di cellule epatiche umane, unitamente alla difficoltà di reperirle. Alcune linee cellulari di fegato umano consentono di eseguire test utili per studiare la tossicità ripetuta di una sostanza; buoni risultati sono stati ottenuti con la coltivazione di cellule epatiche insieme a collagene*

• reni: sebbene laboriosi esistono modelli di strutture renali umane che garantiscono buoni risultati**;

• sistema nervoso centrale: cellule di neuroblastoma umano sono state utilizzate per predire la tossicità subcronica a livello nervoso (ma possono essere utilizzate anche cellule cerebrali umane, dato che le fettine di tessuto cerebrale umano ottenute da autopsia entro 8 ore dopo la morte possono essere mantenute in vitro per estesi periodi – anche 78 giorni – e possono essere manipolate sperimentalmente***);

• polmoni: è disponibile il modello EpiAirway della Mattek (http://www.mattek.com/pages/products/epiairway), costituito da cellule dell’epitelio della trachea e dei bronchi umani che formano una struttura multistrato, utile anche per studi di ricerca su asma, fibrosi cistica e altro;

• midollo: sono state messe a punto colture di cellule umane di vario tipo su un supporto costituito da tessuto di midollo spinale, in grado di sopravvivere dalle 8 alle 12 settimane****.

I metodi appena elencati non sono ancora stati oggetto di studi di validazione, pertanto, sebbene scientificamente attendibili e tecnicamente praticabili non sono utilizzabili ai fini legislativi.

Riferimenti:
* Salman R Khetani & Sangeeta N Bhatia. Microscale culture of human liver cells for drug development. Nature Biotechnology 26, 120 – 126 (2008)
ABSTRACT: http://www.nature.com/nbt/journal/v26/n1/abs/nbt1361.html

**Felder E, Jennings P, Seppi T, Pfaller W. LLC-PK(1) cells maintained in a new perfusion cell culture system exhibit an improved oxidative metabolism. Cell Physiol Biochem. 2002;12(2-3):153-62.

*** Verwer RW, Hermens WT, Dijkhuizen P, ter Brake O, Baker RE, Salehi A, Sluiter AA, Kok MJ, Muller LJ, Verhaagen J, Swaab DF. Cells in human postmortem brain tissue slices remain alive for several weeks in culture. FASEB J. 2002 Jan;16(1):54-60.
ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/11772936

FULL TEXT: http://www.fasebj.org/content/16/1/54.full.pdf

**** Questa coltura di cellule è chiamata LTBMC, dall’inglese long term bone marrow culture (cultura del midollo spinale a lungo termine). Oltre a queste esistono le LTC-Ics (Long Term Culture Initiating cells) e le ML-IC (Myeloid-lymphoid initiating cell), che servono a valutare gli effetti di una sostanza sulla proliferazione delle cellule del midollo ed altre (vedi In: Alternative (non Animal) Methods for Cosmetics Testing: Current Status and Future Prospects. Edited by C. Eskes e V. Zuang; ATLA, Vol. 33, luglio 2005 [http://www.frame.org.uk/atla_issue.php?iss_id=15]).

MUTAGENICITÀ/GENOTOSSICITÀ

Uno studio di mutagenesi, così come altri studi di tossicità, non può prescindere dalla rigorosa caratterizzazione chimica della molecola facendo anche ricorso ai dati esistenti in letteratura su sostanze simili. Successivamente si eseguono i molti test in vitro disponibili:

– Metodi in silico

– Test dell’aberrazione cromosomica di mammifero: serve a valutare il potere di causare deformazioni nella struttura dei cromosomi di cellule di mammifero coltivate in vitro; per la sua esecuzione si possono utilizzare cellule del sangue umano (in particolare linfociti). È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di Ames: consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni su geni singoli. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia. viene eseguito su cellule batteriche coltivate in vitro*. Le prerogative di questo test, tuttora ampiamente utilizzato, sono: il basso costo, la riproducibilità, la semplicità di esecuzione, la rapidità. Sulla base del test di Ames sono stati messi a punto altri tipi di saggi.

– Saggio di mutazione genica in lievito: questo test utilizza cellule di lievito alimentare e consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni su geni singoli. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di ricombinazione mitotica in lievito: questo test utilizza cellule di lievito alimentare e serve a valutare la capacità di una sostanza di indurre scambi di materiale tra sezioni diverse del DNA. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di mutazione genica in cellule di mammifero descritto nella linea guida: per questo saggio si possono impiegare diverse linee cellule, tra cui anche cellule umane; consente di valutare la capacità di una sostanza di indurre mutazioni in geni. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test di sintesi di imprevista sintesi di DNA: questo test serve ad evidenziare la riparazione del DNA a seguito del danno subito dopo l’esposizione ad un agente chimico. Può essere eseguito su diverse linee cellulari. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Saggio dello scambio dei cromatidi fratelli: questo test serve ad evidenziare scambi di materiale genetico tra cromatidi fratelli a seguito del danno subito dopo l’esposizione ad un agente chimico. Può essere eseguito su diverse linee cellulari. È un test validato, ampiamente utilizzato e di comprovata efficacia.

– Test in vitro del micronucleo di mammifero: il test utilizza cellule coltivate e serve a valutare cambiamenti strutturali e numerici nei cromosomi; è ampiamente utilizzato in università ed industria ma non ancora formalmente validato (di questo test esiste anche una versione in vivo).

– Saggio in vitro Comet: questo saggio serve a valutare la rottura di frammenti del DNA in cellule coltivate; è ampiamente utilizzato in università ed industria ma non ancora formalmente validato.

Inoltre si sta sviluppando una nuova frontiera: la tossicogenomica, ovvero l’applicazione della genetica in ambito tossicologico, ma al momento non si è giunti ad una fase di validazione formale dei test.

Riferimenti:

* Nella sua versione originale le cellule batteriche venivano coltivate in estratto di cellule di fegato di ratto; recentemente il test è stato migliorato attraverso l’impiego di materiale umano [Use of human liver S9 in the Ames test: assay of three procarcinogens using human S9 derived from multiple donors. Hakura A, et al.; Regul Toxicol Pharmacol. 2003 Feb;37(1):20-7.] (ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12662906) e [An improvement of the Ames test
using a modified human liver S9 preparation. Hakura A, et al.; J Pharmacol Toxicol Methods. 2001 Nov-Dec;46(3):169-72.] (ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12183193)

TOSSICOCINETICA

I test per lo studio della tossicocinetica vengono eseguiti dopo alcuni altri test (tossicità acuta, ripetuta, subcronica, mutagenesi etc), così molte informazioni utili sono già disponibili per avere una indicazione del metabolismo della sostanza. Poiché il percorso di una molecola all’interno di un organismo coinvolge diversi distretti corporei, è necessario utilizzare batterie di test con cellule differenti. Alcuni metodi attualmente disponibili:

1) Attraversamento di barriere biologiche: i due saggi illustrati servono a fornire indicazioni sulla capacità di una molecola di attraversare barriere biologiche. Sono in corso studi per sviluppare modelli di altre barriere, come la placenta e la barriera emato- encefalica, che si trova “all’ingresso” del cervello. Questi sistemi sono già utilizzati dalle industrie farmaceutiche ma non ancora formalmente validati.

Saggi su cellule intestinali e polmonari. Come modello di barriera intestinale sono impiegate le cellule umane Caco – 2 e Caco – 2/TC 7, con cui è possibile valutare il grado di assorbimento di una sostanza a livello intestinale. Come modello di epitelio polmonare è possibile ricorrere a vari sistemi (vedi anche Test di tossicità ripetuta e subcronica); un esempio sono le cellule BEAS – 2B, isolate da epitelio bronchiale umano.

Membrane artificiali: si tratta di sistemi in vitro costituiti da lipidi che riproducono la struttura di una membrana.

2) Distribuzione della sostanza

Stima del livello plasmatico: il test serve a verificare la capacità della sostanza a legarsi a proteine del plasma umano attraverso l’impiego di appositi apparecchi per la filtrazione.

Coefficiente di ripartizione acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva: è un test che consente di valutare la capacità della sostanza di accumularsi nel tessuto adiposo. Il sistema acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva simula il sistema sangue/tessuto adiposo: maggiore è la tendenza della sostanza a ripartirsi in ottanolo oppure olio di oliva, maggiore è la sua tendenza ad accumularsi nel tessuto adiposo.

Saggio di biotrasformazione 1: si allestisce un preparato costituito da omogenato di fegato umano*, enzimi, ormoni e l’agente da testare. Si prelevano campioni del preparato in diversi momenti analizzando la quantità di sostanza presente: il grado di diminuzione della quantità presente è un indice della metabolizzazione della sostanza da parte del fegato. Questo test è diffusamente impiegato in ambito farmaceutico ma non ancora formalmente validato.

Saggio di bioattivazione: anche in questo saggio vengono utilizzate cellule di fegato, questa volta per verificare la trasformazione da parte dell’organismo della sostanza da testare in sostanza potenzialmente dannosa (da qui “bioattivazione”). Si possono eseguire diversi test, ad esempio aggiungendo degli agenti che inibiscono la bioattivazione: se la tossicità diminuisce in presenza degli inibitori significa che gli effetti tossici sono causati effettivamente dalla bioattivazione. Questo saggio è usato in molti laboratori ma non ancora formalmente validato.

Test in silico di biotrasformazione:

Alcuni di questi metodi impiegati insieme costituiscono una efficace strategia integrata, cui già ricorrono diversi laboratori.

Ad esempio: il sistema Cloe screen e il sistema Cloe PK, sviluppati da Cytoprotex PLC, UK, ampiamente usato in ambito farmaceutico; il sistema Simcyp, sviluppato presso l’Università di Sheffield, UK ed utilizzato da molte industrie farmaceutiche da oltre 15 anni. Questi sistemi sfruttano sia modelli come i QSAR sia batterie di saggi in vitro su cellule diverse dell’organismo umano.

Note:

* Frammenti di fegato umano proveniente da materiale di scarto da interventi chirurgici, vengono sminuzzati fino a formare un preparato omogeneo.

CANCEROGENESI

– Metodi in silico: modello CASE*

– Saggio di trasformazione cellulare: serve a verificare la capacità di una sostanza di trasformare una cellula normale in cancerosa. Questo test è condotto in vitro, ma impiega linee cellulari di topo o di embrione di criceto. Queste linee cellulari sono conservate e mantenute in banche di cellule, pertanto non richiedono il nuovo sacrificio di animali, ma purtroppo per la loro preparazione tempo fa sono stati sacrificati animali. Pur essendo disponibili molte linee cellulari umane, non ne è però previsto l’impiego nei saggi ufficiali. 

– Saggio di comunicazione intercellulare: la rapida proliferazione delle cellule cancerose è consentita grazie anche a dei disordini associati alle normali congiunzioni delle cellule nel tessuto sano. Esiste una relazione positiva tra sostanze in grado di inibire giunzioni tra cellule e insorgenza del cancro. Per eseguire questo saggio possono essere impiegate cellule di vario tipo; il test non ha ancora subito validazione formale.

– Knight ed altri** propongono la sostituzione dei test tradizionali con il seguente protocollo, basato su una combinazione di test:

1. Prima dell’esecuzione del test, tutte le informazioni esistenti circa le sostanze da testare dovrebbero essere riunite e riesaminate criticamente, senza preconcetti, per decidere anzitutto se ulteriori sperimentazioni siano scientificamente giustificate e, se sì, quali.

2. Le indagini iniziali dovrebbero comprendere sistemi QSAR computerizzati, colture cellulari o tessutali, e microarray di DNA. I sistemi QSAR dovrebbero essere impiegati per identificare e valutare gli effetti tossici dei radicali oggetto di sperimentazione. I test di analisi in vitro – tra i quali quello di Ames, quello basato sul Saccharomyces, quelli basati sulla coltura cellulare/tessutale umana – dovrebbero essere impiegati massicciamente, per ricercare eventuali prove di citotossicità, mutageneticità, genotossicità e trasformazione cellulare. I test basati sui microarray di DNA, ben scelti e ben eseguiti, dovrebbero essere impiegati per indagare su eventuali mutamenti di espressione genetica.

3. A seguito di queste indagini iniziali, dovrebbero essere selezionati studi di tossicologia umana non invasivi, per ricostruire la tossicocinetica e calcolare le concentrazioni di sostanza negli organi.

Collazionando appropriatamente i dati così ottenuti, è assai probabile ottenere una descrizione delle potenzialità di cancerogenesi umana di una determinata sostanza, con un grado di predittività molto superiore a quella comunemente offerta dai tradizionali test condotti sui roditori.

Riferimenti:

* Richard, A. M. AND C. R. Williams. PUBLIC SOURCES OF MUTAGENICITY AND CARCINOGENICITY DATA: USE IN STRUCTURE-ACTIVITY RELATIONSHIP MODELS. QSARs of Mutagens and Carcinogens. CRC Press LLC, Boca Raton, FL, , 145-173, (2002).
[http://www.epa.gov/ncct/dsstox/AboutDSSTox/Publications/CRC_QSAR_Richard_Chap5_2003.pdf#search=%22qsar%20case%20carcinogenicity%22]

** Andrew Knight, Jarrod Bailey and Jonathan Balcombe. Animal Carcinogenicity Studies: 3. Alternatives to the Bioassay. ATLA 34, 39–48, 2006

FULL TEXT: http://andrewknight.info/publications/anim_expts_tox/carcino/AK%20et%20al%20Carcino%203%20ATLA%202006%2034(1)%2039-48.pdf

TOSSICITÀ SULLA RIPRODUZIONE

– È recentemente partito un progetto internazionale denominato ReProtect (http://www.reprotect.eu/).

– Test in vitro su spermatozoi per individuare sia danni al DNA che effetti tossici sulle cellule germinali (da cui hanno origine ovuli o spermatozoi): attualmente condotti su spermatozoi di origine bovina.

– Test in vitro su cellule di Leydig: le cellule di Leydig sono le principali cellule implicate nella produzione ormonale maschile. Sono stati messi a punto test che impiegano cellule di provenienza murina (topo) custodite in banche, per cui non è necessario sacrificare altri animali. L’impiego di cellule non umane, solleva comunque problematiche scientifiche, oltre che etiche; d’altra parte biopsie al testicolo umano sono interventi normalmente eseguiti e che potrebbero fornire materiale per una linea cellulare umana, con ovvi vantaggi.

– Test in vitro su cellule del Sertoli: le cellule del Sertoli si trovano nel testicolo ed hanno un ruolo molto importante nello sviluppo degli spermatozoi. Il test è in fase di sviluppo; è possibile da tempo utilizzare cellule del Sertoli umane.

– Test in vitro su cellule ovariche: analogamente ai test eseguiti su cellule del testicolo, lo stesso dicasi per l’ovaio.

– Effetti sul feto: presso l’Università di Rochester vengono eseguiti studi di tossicità su placenta umana per verificare, ad esempio, la capacità di una sostanza di attraversare la placenta. L’utilizzo diffuso di placenta umana rappresenterebbe un grande vantaggio non solo sotto l’aspetto etico e scientifico per le ragione già esposte, ma anche economico, trattandosi di un materiale di scarto.

– Embriotossicità: Al momento sono stati validati tre test di tossicità su embrioni, di cui però solamente uno sostituisce il ricorso ad animali, sebbene impieghi una linea di cellule di embrione di topo, gli altri ne riducono semplicemente il numero normalmente usato.

– Per studiare la potenzialità di una sostanza come distruttore endocrino esistono test in vitro che forniscono una misura della capacità della sostanza di legarsi ai recettori cui normalmente si legano gli ormoni sessuali sulla superficie delle cellule per espletare le loro funzioni. Esiste una “versione” femminile e una maschile, ovvero una specifica per estrogeni ed una per androgeni.

– Modelli in silico: l’Agenzia americana per la Protezione Ambientale (EPA) sta studiando due modelli QSAR, specifici per la tossicità riproduttiva.

ECOTOSSICITÀ

Lo studio degli effetti tossici sull’ambiente prevede già che 16 test su 24 siano effettuati senza il ricorso ad animali: in laboratorio possono essere costruiti modelli di suolo, acque dolci e marine, su cui poter osservare le proprietà biochimiche e fisiche di una sostanza. 

Ad esempio con metodi chimico – analitici è possibile misurare il tempo necessario perchè la sostanza venga degradata ad opera degli agenti atmosferici e/o dei microorganismi;

– per studiare la bioconcentrazione si misura il  coefficiente di ripartizione acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva: è un test di tipo chimico-fisico che consente di valutare la capacità della sostanza di accumularsi nel tessuto adiposo. Il sistema acqua/ottanolo o acqua /olio di oliva simula il sistema sangue/tessuto adiposo: maggiore è la tendenza della sostanza a ripartirsi in ottanolo oppure olio di oliva (la fase lipofila del sistema), maggiore è la sua tendenza ad accumularsi nel tessuto adiposo.

– Attualmente, la ricerca sta puntando sulla costruzione di modelli matematici come i QSAR: un esempio è il progetto Demetra*, finanziato dall’Unione Europea nell’ambito del quinto Programma

Quadro, che prevede la costruzione di un modello QSAR specifico per la ecotossicità. Il progetto vede impegnati anche partners italiani e si basa sulla raccolta di dati di effetti documentati di inquinanti rilasciati nell’ambiente per la costruzione del modello.

– Accanto agli appena citati metodi chimici e metodi in silico, recentemente sono stati messi a punto anche metodi in vitro come ad esempio saggi su colture di cellule di pesce, in particolare la linea PLHC-1, che deriva dal fegato della specie Poeciliopis lucida, utili in saggi di tossicità acuta e cronica e promettenti anche per studi di tossicità sulla riproduzione**.

– Per studi di bioconcentrazione è in corso la messa a punto di un promettente modello in vitro che consiste nell’adattare a studi di ecotossicità un metodo impiegato anche nella ricerca farmaceutica, chiamato PAMPA. Questo modello prevede l’impiego di una membrana artificiale, simile ad una membrana biologica, posta tra due compartimenti, uno dei quali ospiterà la soluzione contenente la sostanza. Si valuta poi la capacità della sostanza di attraversare la membrana***.

Esiste la possibilità di impiegare metodi in vitro anche in sostituzione dell’uso di lombrichi, così come documentato da uno studio canadese che ha messo a punto un metodo non cruento per ottenere colture cellulari di lombrico da impiegare in studi di ecotossicità****.

Riferimenti:

* http://www.demetra-tox.net/index.php

** Fent K. Permanent fish cell cultures as important tools in ecotoxicology. ALTEX. 2007;24 Spec No:26-8.

FULL TEXT: http://www.forschung3r.ch/data/projects/AltexSupl-07-Fent-Bul9.pdf

*** Escher B, Kwon JH. Development of an in vitro system for modeling bioaccumulation of neutral, ionizable, and metabolically active organic pollutants in fish. ALTEX. 2007;24 Spec No:81-2.

FULL TEXT: http://www.forschung3r.ch/en/projects/pr_100_06.html

**** Hendawi M, Sauvé S, Ashour M, Brousseau P, Fournier M. A new ultrasound protocol for extrusion of coelomocyte cells from the earthworm Eisenia fetida. Ecotoxicol Environ Saf. 2004 Sep;59(1):17-22.

ABSTRACT: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15261718

BIOMATERIALI E DISPOSITIVI MEDICI

Esempio: ambito odontoiatrico

I test in questo ambito includono:

– test sui materiali per quanto riguarda le loro caratteristiche chimico-fisiche e meccaniche
– prove di biocompatibilità (un materiale è biocompatibile quando non induce risposta infiammatoria o immunitaria nell’organismo con cui viene a contatto)

Le proprietà chimico-fisiche e meccaniche dei materiali vengono testate su modelli completamente artificiali o su denti di origine umana, provenienti da estrazioni e conservati appositamente per questo scopo.

Per quanto riguarda invece la biocompatibilità, nella maggior parte dei lavori sperimentali la pratica abituale è quella di impiantare i materiali nel corpo degli animali, e dopo un certo periodo ucciderli per prelevare i loro organi, sezionarli e studiarli al microscopio o con altre tecniche.

Metodi sostitutivi:

Utilizzo di cadaveri o coinvolgimento di pazienti (denti estratti, etc), inoltre:

– metodi  in vitro: cellule e tessuti ricostruiti (su http://www.mattek.com si trovano tessuti prodotti con cellule di origine umana, che riproducono la cute e l’epitelio orale e che si possono usare per test di irritazione cutanea e delle mucose).

Per indurre la riformazione dell’osso viene utilizzato osso di origine animale (deantigenato, cioè privato delle proprietà che lo renderebbero suscettibile di rigetto), ma anche sostituti artificial
i e osso umano da donatore (grazie alle Banche dei Tessuti), o osso dello stesso paziente prelevato da altra sede, e i risultati riscontrati sui pazienti indicano che l’osso autologo (preso cioè dalla stessa persona) dà risultati nettamente superiori a quello eterologo (cioè da animale di specie diversa).

[Adattato da: http://www.lav.it/uploads/10/2264_IMPBNMA2ed.pdf]