Comunicazione cervello-cervello negli esseri umani

In questo esperimento, alcuni ricercatori dell’Università di Washington sono riusciti a mettere in comunicazione diretta due cervelli umani, permettendo a un soggetto di giocare a un videogame con le dita di un altro soggetto.

I sensori EEG sono attaccati alla corteccia motoria del primo soggetto in modo da rilevare l’immaginazione motoria (in questo caso il movimento immaginario della mano). Quest’ attività è tradotta e inviata su di una rete di computer grazie a cui si innesca uno Stimolatore Magnetico Transcranico (TMS) che si trova sopra la corteccia motoria del secondo soggetto. Effettivamente il soggetto n°1 immagina di spostare la mano, e la mano del soggetto n°2 si sposta.

[R.P.N. Rao and A. Stocco. Direct Brain-to-Brain Communication in Humans: A Pilot Study. August 12, 2013.]

Link: http://homes.cs.washington.edu/~rao/brain2brain/experiment.html

Objective
We sought to demonstrate that it is possible to send information extracted from one brain directly to another brain, allowing the first subject to cause a desired response in the second subject through direct brain-to-brain communication. A task was designed such that the two subjects could cooperatively solve the task by transmitting a meaningful signal from one brain to the other.  

Methods
Experimental Set-Up
The experiment leverages two existing technologies: electroencephalography (or EEG) for noninvasively recording brain signals from the scalp and transcranial magnetic stimulation (or TMS) for noninvasively stimulating the brain.

Figure 1 illustrates the experimental paradigm. Electrical brain activity from Subject 1 (the “Sender”) is recorded using EEG (Figure 2) in the Neural Systems Laboratory in the Computer Science and Engineering building at UW. This brain activity is interpreted by a computer and is transmitted (when classified as a valid motor imagery signal) over the internet to the TMS machine in the Institute for Learning and Brain Sciences (I-LABS) building at UW. The TMS machine delivers a magnetic stimulation pulse to the left motor brain region of Subject 2 (the “Receiver”), causing the right hand to press a key (Figure 3). 

The Task
The task that the subjects must cooperatively solve via brain-to-brain communication is a computer game (Figure 4). The task involves saving a “city” (on the left) from getting hit by rockets fired by a “pirate ship” from the lower right portion of the screen (depicted by skull-and-bones). To save the city, the subjects must fire a “cannon” located at the lower center portion of the screen. If the “fire” button is pressed before the moving rocket reaches the city, the rocket is destroyed (Figure 5), the city is saved, and the trial ends. To make the task more interesting, on some trials, a friendly “supply plane” may appear instead of a pirate rocket and move leftwards towards the city (Figure 6).  The subjects must avoid firing the cannon at the supply plane. 

Brain-to-Brain Collaboration between the Two Subjects
Only Subject 1 (the “Sender”) watches the game (Figure 2, Sender watching the game screen, which is not shown). The Sender is unable to press the “fire” button which is only available to Subject 2 (the “Receiver”). The Sender can however engage in motor imagery of the right hand (i.e., imagine moving their right hand) – this imagery signal is recognized by the computer and translated to a magnetic stimulation pulse that is delivered to the left motor cortex region of the Receiver. The stimulation causes a quick upward jerk of the Receiver’s right hand, which is resting slighty above the “fire” key on a keyboard (Figure 3). This up-down movement of the hand typically (though not always) results in the “fire” key being hit, causing the cannon in the computer game to be fired as requested by the Sender. If the moving target happens to be the supply plane, the Sender can choose not to fire the cannon at the plane by resting and not engaging in any motor imagery.

Decoding Motor Imagery from EEG
Electrical signals were recorded from the Sender’s scalp using the noninvasive technique of EEG.  We used a USBamp EEG recording system (Guger Technologies, Austria) with gold-plated electrodes placed over the left hemisphere at standard locations under the 10-20 convention (sampling frequency = 256Hz). A Laplacian spatial filter was used to reduce artifacts common to nearby electrodes and emphasize local activity. The power in a low frequency band (the “mu” band) was computed across the electrodes and the electrode most correlated with the subject’s motor imagery during an initial training period was selected as the control electrode for the task. Changes in the “mu” band have long been linked to motor imagery signals and used in BCIs (for an introduction, see [1]).  The computer translated the power in the mu band to upward movement of a cursor (left side of Figure 4). Specifically, right hand imagery typically causes a decrease in power which was mapped to upward movement of the cursor. If the cursor hit the blue circular target at the top, the computer decides that the Sender has engaged in motor imagery and sends a stimulation pulse to the Receiver.

Stimulation using TMS
The Receiver receives information from the Sender via transient noninvasive brain stimulation induced by a rapidly changing magnetic field. The magnetic field is generated by a special coil held over the Receiver’s head and kept in place by an orientable mechanical arm mounted on the Receiver’s chair. This stimulation technique is called Transcranial Magnetic Stimulation (TMS) and is a well-established noninvasive means to directly influence the activity of a specific spot on the brain’s surface. Note that no electrical pulse is given to the Receiver and stimulation is induced only indirectly through the changing magnetic field. A MagStim Rapid² model TMS machine was used with a single-pulse TMS protocol. The pulse was delivered though a circle coil at 69% of the machine’s power output. The TMS coil was localized over the part of the Receiver’s brain that controls the wrist and fingers. The Receiver kept one or more fingers on a standard computer keyboard’s space bar (the designated “fire” key). The TMS pulse produced a muscle twitch and upward hand movement, typically resulting in the space bar being hit as a result and firing the cannon in the Sender’s computer game.

Results
The pilot study involved 2 subjects, both researchers involved in the study (R. Rao as “Sender” and A. Stocco as “Receiver”). The pilot study was approved by the University of Washington Institutional Review Board (IRB) within the Human Subjects Division.

Four experimental sessions were conducted, each with 5-7 trials. Session 1 was terminated early due to network communication issues, which were resolved as the subjects waited for the next session. Sessions 2, 3, and 4 witnessed successful transmission of information from the Sender to the Receiver. 

In Sessions 2 and 3, while the Receiver’s performance was highly accurate (~90% success rate in stimulation causing the hand to move and the cannon being fired), the Sender’s performance was closer to chance levels as the subject reported being in the process of learning to generate the appropriate signal (imagery or rest) given the type of target. 

In Session 4, both the Sender and Receiver achieved close to perfect performance (Sender: 100% correct detection and transmission of appropriate signal, Receiver: 100% correct elicitation of hand movement upon stimulation; 1 stimulation not causing the “fire” key to be hit). A portion of the session log is given below (“Missile” = pirate rocket, “Airplane” = su
pply plane) :
2013-08-12 15:47:37.472000: Starting experiment
2013-08-12 15:47:47.549000: Starting trial: Airplane
2013-08-12 15:47:48.008000: arming stimulator by key press
2013-08-12 15:48:04.106000: Missiles hit: 0, Airplanes hit: 0, Attempts: 1
2013-08-12 15:48:14.165000: Starting trial: Missile
2013-08-12 15:48:17.200000: BCI input received.  Sending TMS pulse.
2013-08-12 15:48:19.691000: Shot fired
2013-08-12 15:48:19.691000: Missiles hit: 1, Airplanes hit: 0, Attempts: 2
2013-08-12 15:48:29.757000: Starting trial: Missile
2013-08-12 15:48:30.062000: BCI input received.  Sending TMS pulse.
2013-08-12 15:48:32.417000: Shot fired
2013-08-12 15:48:32.417000: Missiles hit: 2, Airplanes hit: 0, Attempts: 3
2013-08-12 15:48:42.460000: Starting trial: Missile
2013-08-12 15:48:54.340000: BCI input received.  Sending TMS pulse.
2013-08-12 15:49:03.423000: Missiles hit: 2, Airplanes hit: 0, Attempts: 4
2013-08-12 15:49:13.457000: Starting trial: Airplane
2013-08-12 15:49:29.572000: Missiles hit: 2, Airplanes hit: 0, Attempts: 5
2013-08-12 15:49:39.615000: Starting trial: Missile
2013-08-12 15:49:40.910000: BCI input received.  Sending TMS pulse.

Conclusion
The results suggest that information extracted noninvasively from one brain using EEG can be transmitted to another brain noninvasively using TMS to allow two persons to cooperatively solve a task via direct brain-to-brain transfer of information. The next phase of the study will attempt to quantify this transfer of information using a larger pool of human subjects. 

Background and References 

1. For background on brain-computer interfacing, see: 
   • Brain-Computer Interfacing: An Introduction (Cambridge University Press, 2013)
   • Brain-Computer Interfaces: Principles and Practice (Oxford Univ. Press, 2012)
   • Toward Brain-Computer Interfacing (MIT Press, 2007)
2. For a description of related experiments by other groups, see the recent article: 
   • Computer-Brain Interfaces Making Big Leaps (by Nick Bilton, August 4, 2013)

 

Figure 1. Experimental Set-Up. Brain signals from Subject 1 (the “Sender”) were recorded using EEG. When imagined hand movements were detected by the computer, a “fire” command was transmitted over the internet to the TMS machine, which caused an upward movement of the right hand of Subject 2 (the “Receiver”), usually resulting in the “fire” key being hit. 

Figure 2. EEG signals being recorded from Subject 1 (the “Sender”) as the subject watches the computer game (the game screen is to the left and not shown in the picture). The larger screen displays EEG signals processed by the BCI2000 software. The smaller laptop screen placed further away is from the live Skype session and shows Subject 2 in the TMS lab across campus. Researcher Dev Sarma monitors the experiment. (Picture by researcher Bryan Djunaedi) 

Figure 3. Subject 2 (the “Receiver”) with TMS coil placed over left motor cortex region and right hand resting slightly above the “fire” key on  the keyboard. The screen behind the subject shows the Sender’s game screen which is not seen by the Receiver. 

Figure 4. Screen shot of the cannon game. A pirate ship on the right side (skull-and-bones) shoots a rocket towards a city on the left. The Sender engages in motor imagery to move the white cursor on the left to hit the blue target.

Figure 5. If the Sender is able to use motor imagery to move the white cursor to the circular target (which turns red), a stimulation signal is sent to the Receiver located elsewhere. This stimulation causes a movement of the Receiver’s hand, usually resulting in the “fire” key being hit on the Receiver’s keyboard. This causes the cannon in the Sender’s game to fire and destroy the pirate rocket before it hits the city.

Figure 6. In some trials, a friendly supply plane may move from right to left instead of a pirate rocket. The Sender must in this case rest rather than engage in imagery to make the cursor move away from the blue target and prevent any firing of the cannon at the supply plane.

Mini-pancreas ottenuto da cellule staminali per lo studio del diabete

Riportiamo questo importante studio, nonostante siano state utilizzate cellule animali, che possono comunque essere sostituite da corrispettive umane:

[Chiara Greggio, Filippo De Franceschi, Manuel Figueiredo-Larsen, Samy Gobaa, Adrian Ranga, Henrik Semb, Matthias Lutolf and Anne Grapin-Botton. Artificial three-dimensional niches deconstruct pancreas development in vitro. Development 2013 140:4452-4462.]

Full Text: http://dev.biologists.org/content/140/21/4452.full

Abstract:

Nel contesto di una terapia cellulare per il diabete, i metodi espansione di un progenitore del pancres e la conseguente differenziazione in cellule-beta produttrici di insulina sono di enorme valore. Qui stabiliamo condizioni di colture tridimensionali in Matrigel che rendono possibile un’efficace espansione di progenitori embrionali dissociati di pancreas del topo. Manipolando la composizione dell’elemento generiamo sia sfere vuote, che sono principalmente composte da progenitori del pancreas, o organoidi complessi che spontaneamente subiscono una morfogenesi e differenziazione pancreatica. Il mantenimento e l’espansione in vitro di progenitori del pancreas richiedono vie di segnalazione Notch e FGF attive, ricapitolando così le interazioni evidenziate in vivo. I nostri esperimenti dimostrano nuovi aspetti sullo sviluppo del pancreas, come l’effetto comunità secondo il quale piccoli gruppi di cellule mantengono meglio le proprietà di progenitore e si espandono in modo più efficente rispetto a cellule isolate, così come il requisito della tridimensioanltà. Per ultimo, le condizioni di crescita in biomateriali chimicamente definiti aprono la strada per testare le proprietà biofisiche e biochimiche della nicchia che sostiene i progenitori del pancreas.

Traduzione di [E.D.C.]

Progetto InLiveTox: Bioreattori Multicompartimentali e Nanoparticelle

Il progetto InLiveTox, che è stato finanziato dall’UE nel corso degli ultimi tre anni, ha fatto progredire in modo significativo l’efficienza degli esperimenti in vitro sulle nanoparticelle. Il progetto si è concentrato sull’impatto dell’esposizione alle nanoparticelle su intestino, sistema cardiovascolare e fegato. L’esposizione mediante ingestione è particolarmente importante a causa dell’inclusione delle nanoparticelle in alimenti, imballaggi alimentari e medicine somministrate per via orale. 

Il progetto ha sviluppato un nuovo sistema modulare di test in vitro basato sulla fluidica e ha dimostrato il suo uso per modellare la risposta di tessuti selezionati all’ingestione di nanoparticelle. I risultati ottenuti dal sistema in vitro sono stati convalidati da uno studio in vivo su biocinetica e tossicità delle nanoparticelle mediante ingestione nei ratti. Dei tessuti di questi animali sono stati usati per studiare le reazioni tossicologiche, concentrandosi nuovamente su intestino, sistema cardiovascolare e fegato. Questi dati sono stati poi confrontati con altri studi biocinetici effettuati usando particelle simili, ma altre vie di esposizione (ad es. le vie aeree). Il confronto dei dati è stato ottenuto in vivo sull’esposizione mediante iniezione e ingestione con dati ottenuti da saggi standard (tipo statico a singola cellula). Il sistema sviluppato ha mostrato un notevole schema di differenze e similarità, in particolare durante lo studio delle infiammazioni. Vi erano differenze nette nella pertinenza fisiologica dei differenti approcci. 

Questo significa che i risultati del progetto InLiveTox potrebbero avere il potenziale per cambiare il modo in cui i settori farmaceutico, chimico, cosmetico e alimentare testano sicurezza ed efficienza dei nuovi materiali. I metodi migliorati potrebbero apportare significativi benefici economici sia mediante la riduzione dei costi dei test se confrontati all’uso di animali, ma anche mediante l’opportunità di portare sul mercato prodotti più sicuri in modo più veloce rispetto ai metodi attuali, soddisfacendo allo stesso tempo la legislazione REACH. 

La tecnologia sviluppata in questo progetto potrebbe fornire un significativo vantaggio a chi la adotterà da subito. Essa può essere usata come strumento di test e ricerca in tossicologia e farmacologia per qualsiasi nuova entità chimica. I risultati del progetto hanno superato in molti modi le aspettative, fornendo una tecnologia eccitante e innovativa che ha il potenziale per sostenere gli sviluppi di nuovi prodotti nel settore dei test in vitro. A livello macro, il progetto conferma la posizione competitiva in campo internazionale che gli enti di ricerca europei occupano nel settore in rapido sviluppo dei test in vitro. 

Il consorzio è un gruppo interdisciplinare composto dai leader europei in nanotossicologia, farmacia e ingegneria a livello europeo, assieme a un importante gruppo di ricerca americano proveniente dalla University of Rochester nell’ambito dell’invito FP7-NMP-2008-1.3-2 del 7° PQ.

Per maggiori informazioni, visitare: 

Progetto InLiveTox 
http://www.inlivetox.eu/

Tratto da: http://cordis.europa.eu/fetch?CALLER=IT_NEWS&ACTION=D&SESSION=&RCN=35512

Dal dossier finale:

[…] At a meso level, the results of the InLiveTox project have the potential to change the way that the pharmaceutical, chemical, cosmetic and food sectors of industry are testing the safety and efficiency of new materials. The improved methods could deliver significant economic benefits both through reduction of testing costs compared to the use of animals, but also through the opportunity to bring safer products to market faster than existing methods. The technology developed in the project could provide a significant competitive advantage to the early adopters.

At a macro level, the project confirms the internationally competitive position that Europe‟s research organisations hold in the fast developing field of in vitro testing. A report by the US National Research Council in 2007 entitled “Toxicity Testing in the 21st Century” outlined the scale of the challenges and suggested a 15 year time scale for the replacement of many animal testing methods by in-vitro techniques.

The WYSS Institute in Boston, USA, has recently been granted $26 million for a project to develop a „lab-on-a-chip‟ solution to toxicity testing. The capability demonstrated by the InLiveTox project shows that EU researchers could be leaders in this field, if they are able to secure similar levels of funding.

The motivation for such an investment is the size of the existing (£1.8 billion) market for drug toxicity testing and also the emerging (£2 billion) market for the testing of chemicals to comply with REACH legislation.

Any change in methodology for the testing of new drugs will require regulatory approval. The regulatory bodies (ECVAM, FDA etc) are justifiably cautious in approving new methods.
However the cornerstone to any change is sound science and the work of the InLiveTox team has demonstrated the capability of European research organisations to make significant progress.

[ http://www.inlivetox.eu/uploads/media/InLiveTox-Final_publishable_report.pdf ]

Progetto ESNATS: sostituire gli animali con cellule staminali embrionali

Sostituire la sperimentazione animale con accurate innovazioni in vitro.

Nel testo:

“È importante sottolineare che l’ESNATS ha dimostrato che questi sistemi di test umani offrono prove più accurate rispetto ai test sugli animali”

An EU-funded project has successfully established human stem cell-based in vitro tests, which are capable of replicating the development of the human central nervous system. The innovation could lead to the more accurate and efficient testing of drugs, and importantly lead to a move away from animal testing.
The Embryonic Stem cell-based Novel Alternative Testing Strategies (ESNATS) project’s objective was to develop a novel toxicity test platform based on embryonic stem cells (ESCs). A proof of concept study demonstrated that compounds causing developmental neurotoxicity were successfully identified in these systems. The breakthrough could accelerate drug development, reduce related R&D costs and propose a powerful alternative to animal tests.

– Il progetto quinquennale è stato completato alla fine di settembre 2013. Si è tenuta recentemente una conferenza con la Società Europea per le Alternative ai Test Animali ( EUSAAT ), Congresso a Linz, in Austria, al fine di condividere i principali risultati del progetto e discutere le possibili implicazioni per il futuro.

– Evitare i composti che causano tossicità riproduttiva è di fondamentale importanza per la sicurezza umana. Tuttavia, i test di tossicità riproduttiva sono anche uno dei campi più difficili e costosi della tossicologia. Un numero importante di animali è richiesto lo sviluppo dei farmaci – infatti, servono centinaia di animali per testare un singolo composto.

– Per far fronte a questo, l’ESNATS ha sviluppato una gamma di test di tossicità usando ESCs sottoposti a cultura standardizzata e protocolli di differenziazione. Queste diverse prove riguardano la tossicità riproduttiva, la neurotossicità, il metabolismo e la tossicocinetica. L’obiettivo era quello di sviluppare un sistema integrato di prova “all in one “.

– È importante sottolineare che l’ESNATS ha dimostrato che questi sistemi di test umani offrono prove più accurate rispetto ai test sugli animali.

(tratto da LIMAV: https://www.facebook.com/photo.php?fbid=637348702976507&set=pb.555022877875757.-2207520000.1382211907.&type=3&theater)

Il miglior modello per l’Uomo è l’Uomo: il Microdosing

[Seymour M. The best model for humans is human — how to accelerate early drug development safely. Altern Lab Anim. 2009 Sep;37 Suppl 1:61-5.]

Full Text: http://www.frame.org.uk/atla_article.php?art_id=1205&pdf=true

Abstract:

Tradizionalmente, la scelta di quali composti sono candidati ideali da portare avanti nello sviluppo si è basata soprattutto sui dati pre-clinici. Tuttavia, la mancanza di predittività della situazione clinica umana nei modelli utilizzati ha portato a decisioni di scarso valore, aggravate dal fatto che più tardi nello sviluppo questi errori vengono realizzati, più costosa e dispendiosa in termini di tempo è la loro correzione. 
Inoltre, composti che potrebbero essere stati sviluppati in farmaci, sono stati abbandonati a causa della scarsa farmacocinetica nei modelli animali.
La spettrometria di massa con acceleratore (AMS) è una tecnica di rivelazione ultrasensibile che può essere usata per quantificare il carbonio 14. Con la somministrazione di piccole quantità di sostanze marcate con il carbonio-14 l’AMS può essere utilizzato per ottenere dati clinici umani nelle fasi iniziali del processo di sviluppo dei farmaci. Tali studi : a) possono essere utili per capire la farmacocinetica umana utilizzando la tecnica del microdosing; b) sono in grado di fornire informazioni sul metabolismo umano, per convalidare la scelta delle specie animali usate nei test di sicurezza pre-clinica e identificare metaboliti umani unici o sproporzionati durante la fase 1, e c) sono in grado di fornire dati di farmacocinetica umani fondamentali, tra i quali la biodisponibilità assoluta, favorendo uno scientificamente ottimale e conveniente design di studio. Avere a disposizione questi dati clinici il prima possibile potrà portare a migliorare il processo decisionale e quindi di ridurre i tempi e i costi coinvolti nel processo di sviluppo dei farmaci.

Modello in vitro di Cheratocono

[Karamichos D, Zareian R, Guo X, Hutcheon AE, Ruberti JW, Zieske JD. Novel in Vitro Model for Keratoconus Disease. J Funct Biomater. 2012 Nov 13;3(4):760-775.]

Full Text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3719435/

Abstract:

Keratoconus is a disease where the cornea becomes cone-like due to structural thinning and ultimately leads to compromised corneal integrity and loss of vision. Currently, the therapeutic options are corrective lenses for early stages and surgery for advanced cases with no in vitro model available. In this study, we used human corneal fibroblasts (HCFs) and compared them to human Keratoconus fibroblasts (HKCs) cultured in a 3-dimensional (3D) model, in order to compare the expression and secretion of specific extracellular matrix (ECM) components. For four weeks, the cells were stimulated with a stable Vitamin C (VitC) derivative ± TGF-β1 or TGF-β3 (T1 and T3, respectively). After four weeks, HKCs stimulated with T1 and T3 were significantly thicker compared with Control (VitC only); however, HCF constructs were significantly thicker than HKCs under all conditions. Both cell types secreted copious amounts of type I and V collagens in their assembled, aligned collagen fibrils, which increased in the degree of alignment upon T3 stimulation. In contrast, only HKCs expressed high levels of corneal scarring markers, such as type III collagen, which was dramatically reduced with T3. HKCs expressed α-smooth muscle actin (SMA) under all conditions in contrast to HCFs, where T3 minimized SMA expression. Fast Fourier transform (FFT) data indicated that HKCs were more aligned when compared to HCFs, independent of treatments; however, HKC’s ECM showed the least degree of rotation. HKCs also secreted the most aligned type I collagen under T3 treatment, when compared to any condition and cell type. Overall, our model for Keratoconus disease studies is the first 3D in vitro tissue engineered model that can mimic the Keratoconus disease in vivo and may be a breakthrough in efforts to understand the progression of this disease.

Modello in vitro di diabete con i Bioreattori Multicompartimentali Modulari (McmB)

“Dai laboratori dell’Università di Pisa arriva uno studio innovativo per aiutare a prevenire le malattie metaboliche: grazie a una ricerca interdisciplinare condotta da Arti Ahluwalia, professoressa di Bioingegneria, e dal suo gruppo del Centro di Ricerca Interdipartimentale “E. Piaggio”, è stato riprodotto in vitro il primo modello di diabete. “Nel nostro esperimento abbiamo riprodotto in vitro molte delle alterazioni caratteristiche del metabolismo umano, simulando lo stress a cui sono sottoposti gli organi a causa del diabete”, spiega Arti Ahluwalia. “Il sistema ha risposto come il corpo umano, mostrando gli stessi segni di danno che compaiono al livello sistemico e nel tessuto vascolare in presenza della malattia”.

I risultati della ricerca, pubblicati sulla rivista PLoS ONE nell’articolo “Glucose and Fatty Acid Metabolism in a 3 Tissue In-Vitro. Model Challenged with Normo- and Hyperglycaemia”, sono di grande rilievo non solo per lo studio delle malattie dismetaboliche (tra cui l’obesità), ma quanto per le sue potenziali applicazioni allo studio di altre patologie e quindi alla realizzazione di nuovi modelli fisiopatologici. Si aprono così una serie di possibilità d’indagine nella ricerca di segnali tissutali integrati, che fino ad oggi era stata ritenuta impossibile in vitro. La ricerca ha visto l’utilizzo dell’innovativo sistema di coltura cellulare Quasi-Vivo®, che nel frattempo è stato concesso in licenza alla Kirkstall Ltd. Tutti gli esperimenti sono stati condotti dalla dottoressa Bruna Vinci, durante il suo dottorato e il suo post-doc, dividendo la sperimentazione e trascorrendo il suo tempo tra i laboratori dell’Università di Pisa.

Nello studio descritto, sono stati coltivati insieme tre tipi di cellule derivanti da altrettanti tessuti attivi e responsivi al metabolismo di substrati energetici e molecole secondarie (cellule da tessuto epatico, tessuto adiposo e cellule da tessuto endoteliale). Le cellule e i tessuti, posti in un sistema di coltura a “tre comparti separati” comunicanti e collegati grazie un flusso di un mezzo di coltura comune, sono stati sottoposti a condizioni simulanti sia stati fisiologici che patologici post-prandiali (ad es. normo- e iperglicemia da alimentazione). I risultati sono stati sorprendenti perché hanno dimostrano che una cultura multipla di tessuti collegati secondo schemi razionali e in scala allometrica, può simulare e riassumere (in maniera semplificata) molte delle alterazioni caratteristiche del metabolismo umano in sovraccarico nutrizionale, come ad esempio l’infiammazione sistemica e danno vascolare.

Le malattie metaboliche sono spesso legate a un eccesso di tessuto adiposo. 3Queste patologie sono la prima causa di morbilità e mortalità nel nostro paese in un progressivo aumento legato all’innalzamento della vita media della popolazione. Il diabete, come altre malattie metaboliche è multifattoriale; ha natura infiammatoria, genetica ed epigenetica, ed è diventata una malattia fortemente penalizzante per la qualità e la durata della vita poiché crea complicazioni decise prevalentemente a carico dell’apparato cardio-circolatorio.

Là dove la prevenzione delle malattie metaboliche è insufficiente, cresce l’impegno per il miglioramento del suo trattamento specifico nella prospettiva di una medicina sempre più mirata e personalizzata. Gli sforzi scientifici s’indirizzano verso modelli di studio in vitro sempre più complessi e vivosimilari, avvalendosi di nuove tecnologie capaci d’integrare principi di natura diversa. Questi sforzi permettono di individuare le interazioni tra i vari tessuti e il ruolo specifico di ogni organo nella omeostasi metabolica. Inoltre, permettono di abbattere l’utilizzo di animali per il testing di farmaci e come modelli di patologie umane, da cui è nota la difficoltà e imprecisione a estrapolare alla casistica umana.”

Preso da: http://www.intoscana.it/intoscana2/opencms/intoscana/sito-intoscana/Contenuti_intoscana/Canali/Salute/visualizza_asset.html?id=1140905

Riportiamo, in aggiunta, l’abstract della ricerca:

Nutrient balance in the human body is maintained through systemic signaling between different cells and tissues. Breaking down this circuitry to its most basic elements and reconstructing the metabolic network in-vitro provides a systematic method to gain a better understanding of how cross-talk between the organs contributes to the whole body metabolic profile and of the specific role of each different cell type. To this end, a 3-way connected culture of hepatocytes, adipose tissue and endothelial cells representing a simplified model of energetic substrate metabolism in the visceral region was developed. The 3-way culture was shown to maintain glucose and fatty acid homeostasis in-vitro. Subsequently it was challenged with insulin and high glucose concentrations to simulate hyperglycaemia. The aim was to study the capacity of the 3-way culture to maintain or restore normal circulating glucose concentrations in response to insulin and to investigate the effects these conditions on other metabolites involved in glucose and lipid metabolism. The results show that the system’s metabolic profile changes dramatically in the presence of high concentrations of glucose, and that these changes are modulated by the presence of insulin. Furthermore, we observed an increase in E-selectin levels in hyperglycaemic conditions and increased IL-6 concentrations in insulin-free-hyperglycaemic conditions, indicating, respectively, endothelial injury and proinflammatory stress in the challenged 3-way system.

[Iori E, Vinci B, Murphy E, Marescotti MC, Avogaro A, et al. (2012) Glucose and Fatty Acid Metabolism in a 3 Tissue In-Vitro Model Challenged with Normo- and Hyperglycaemia. PLoS ONE 7(4): e34704]

Modelli in silico per la predizione della mutagenicità e della cancerogenicità

[Benfenati E, Benigni R, Demarini DM, Helma C, Kirkland D, Martin TM, Mazzatorta P, Ouédraogo-Arras G, Richard AM, Schilter B, Schoonen WG, Snyder RD, Yang C. Predictive models for carcinogenicity and mutagenicity: frameworks, state-of-the-art, and perspectives. J Environ Sci Health C Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 2009 Apr;27(2):57-90.]

Abstract:

Mutagenicity and carcinogenicity are endpoints of major environmental and regulatory concern. These endpoints are also important targets for development of alternative methods for screening and prediction due to the large number of chemicals of potential concern and the tremendous cost (in time, money, animals) of rodent carcinogenicity bioassays. Both mutagenicity and carcinogenicity involve complex, cellular processes that are only partially understood. Advances in technologies and generation of new data will permit a much deeper understanding. In silico methods for predicting mutagenicity and rodent carcinogenicity based on chemical structural features, along with current mutagenicity and carcinogenicity data sets, have performed well for local prediction (i.e., within specific chemical classes), but are less successful for global prediction (i.e., for a broad range of chemicals). The predictivity of in silico methods can be improved by improving the quality of the data base and endpoints used for modelling. In particular, in vitro assays for clastogenicity need to be improved to reduce false positives (relative to rodent carcinogenicity) and to detect compounds that do not interact directly with DNA or have epigenetic activities. New assays emerging to complement or replace some of the standard assays include Vitotox, GreenScreenGC, and RadarScreen. The needs of industry and regulators to assess thousands of compounds necessitate the development of high-throughput assays combined with innovative data-mining and in silico methods. Various initiatives in this regard have begun, including CAESAR, OSIRIS, CHEMOMENTUM, CHEMPREDICT, OpenTox, EPAA, and ToxCast. In silico methods can be used for priority setting, mechanistic studies, and to estimate potency. Ultimately, such efforts should lead to improvements in application of in silico methods for predicting carcinogenicity to assist industry and regulators and to enhance protection of public health.

Sostituire gli esperimenti sugli animali: Scelte, sorti e sfide

Traduzione di Cecco Amaro

[Langley G, Evans T, Holgate ST, Jones A. Replacing animal experiments: choices, chances and challenges. Bioessays. 2007 Sep;29(9):918-26.]

Articolo in lingua originale: http://animalexperiments.info/resources/Studies/Alternatives/Replacement.-Langley-et-al.-2007./Replace-Langley-et-al-2007-Bioessays.pdf

Sommario

La sostituzione delle procedure sugli animali con metodologie quali cellule e tessuti in vitro, studi su volontari, tecniche fisico-chimiche e computer modelling, è motivata da necessità legislative, scientifiche e morali. Gli approcci senza animali oggi sono considerati metodologie avanzate che possono superare molte delle limitazioni degli esperimenti sugli animali. Le analisi in vitro per testare farmaci e prodotti chimici hanno risparmiato centinaia di migliaia di animali. Al contrario, l’uso accademico di animali continua ad aumentare e la nozione di sostituzione sembra molto meno accettata  nella ricerca universitaria. Ciò nonostante, alcuni procedimenti sugli animali sono stati sostituiti nella ricerca neurologica, riproduttiva e dentistica, e sono stati compiuti progressi in altri campi come le malattie respiratorie, la terapia del dolore e la sepsi. Passare in rassegna in maniera sistematica l’applicabilità dei dati animali al contesto clinico può incoraggiare una nuova prospettiva per nuovi metodi senza animali e ci si attendono tanti più progressi nella sostituzione quanto più diventano disponibili maggiori finanziamenti.

Introduzione

La preoccupazione del pubblico per gli esperimenti sugli animali ha una lunga storia e si è intensificata negli ultimi due decenni. Le preoccupazioni si concentrano principalmente sulle sofferenze causate ad animali senzienti sia durante gli esperimenti che nell’isolamento in un laboratorio. I critici sottolineano inoltre che la validità degli esperimenti su animali è spesso ipotizzata piuttosto che provata e che essi esigono alti costi e tempi lunghi.  Le linee di condotta sulla ricerca animale che regolano il finanziamento sia pubblico che scientifico rimangono vaghe e si sta invertendo la trentennale tendenza al ribasso del numero degli esperimenti.

Una soluzione fondamentale è lo sviluppo di metodi di ricerca e test originali o adattati che possano prendere il posto degli esperimenti sugli animali e non solo evitarne l’uso. Lo sviluppo di tecniche di sostituzione, incluso nella nozione accettata internazionalmente delle Tre R (rimpiazzare, ridurre e rifinire), non è nè nuovo nè non sperimentato: dal 1986, le legislazioni nazionale (Regno Unito, ndt) ed Europea richiedono che tecniche equivalenti non animali debbano essere usate al posto di esperimenti sugli animali. Negli USA una restrizione analoga opera a livello istituzionale. Nell’ Unione Europea, la Commissione e gli stati membri si impegnano ad incoraggiare la ricerca secondo modalità che possano raggiungere gli stessi scopi ma usando meno animali o nessuno. Per questa ragione nel 1991 è sorto il Centro europeo per la convalida dei metodi alternativi (European Centre for the Validation of Alternative Methods – ECVAM), che ha avvalorato con successo più di 18 metodi di sostituzione completa o parziale, otto dei quali hanno già conquistato accettazione normativa.

Il governo britannico si è fatto promotore delle Tre R fondando nel 2004  il ‘Centro Nazionale per il Rimpiazzo, Riduzione e Rifinimento (dell’uso) degli animali nella ricerca’, il cui scopo finale è la sostituzione di tutti gli esperimenti sugli animali. Esistono simili centri in Germania, Austria, Paesi Bassi, Giappone e in altri luoghi. È crescente il consenso sul fatto che i metodi di ricerca senza animali siano tecniche avanzate, che hanno il potenziale di migliorare il progresso medico e scientifico con spese minori e in meno tempo. Come ha affermato il governo britannico, i metodi alternativi sono spesso in realtà, “(…) ‘metodi avanzati’ che ampliano la portata e sormontano alcune limitazioni dei modelli animali esistenti”.

In questo resoconto discutiamo le origini e le applicazioni di alcuni metodi di sostituzione di successo già usati nella ricerca medica fondamentale e in test normativi, osservando tre campi di ricerca (sepsi, malattie respiratorie e dolore) come occasioni per sostituire ulteriormente gli esperimenti con animali e di avere sviluppi futuri. 

Sostituire le procedure con animali

La sostituzione delle procedure animali è un’idea ben radicata nell’industria, soprattutto nei settori farmaceutici, chimici e  cosmetici, ma sembra molto meno conosciuta nell’ambiente universitario. Gli esperimenti sugli animali condotti dall’industria in Gran Bretagna sono significativamente diminuiti per diversi anni, ma quelli eseguiti nelle università e scuole di medicina sono aumentati del 52% nell’ultimo decennio. I riusciti esempi di sostituzione che seguono sono stati selezionati fra i molti, per illustrare diversi percorsi e ragioni per lo sviluppo e l’attuazione di metodi di sostituzione. 

Test sulla regolamentazione dei medicinali e prodotti chimici

La sicurezza o la qualità dei test di farmaci o di sostanze chimiche sono aree dove la sostituzione dei metodi basati sugli animali è molto diffusa, sia nel settore industriale che fra le autorità di regolamentazione.

In ambito normativo , i nuovi test sono convalidati con un processo formale concordato a livello internazionale. Diverse tecniche sostitutive sono state convalidate ed approvate con successo. Dal 2000, tre metodi in vitro o sintetici hanno ottenuto accettazione a livello normativo per testare la corrosività chimica: l’analisi di pelle di ratto e di modelli di pelle umana e il modello Corrositex hanno sostituito violenti test in vivo su conigli. Il saggio di assunzione del rosso neutro con cellule per la fotosensibilità è accettato internazionalmente, evitando test sui topi. I dati provenienti dal metodo in vitro che stima la penetrazione cutanea di farmaci, pesticidi e sostanze chimiche sono internazionalmente accettati, sostituendo molti studi sui topi. Nel 2007 l’ECVAM ha approvato due test in vitro su modelli di pelle umana come sostituti per test in vivo di irritazione cutanea sui conigli.

Altre tecniche sono state validate scientificamente e sono in cantiere normativo, come nuovi test della pirogenicità in vitro. I farmaci parenterali devono essere testati per i pirogeni per escludere la possibilità di contaminazione batterica. L’originale test in vivo, introdotto nel 1940, misura la reazione alla febre con una sonda rettale inserita in conigli immobilizzati con un collare di ferro simile a una gogna. Alcuni animali possono soffrire di febbre, problemi respiratori o shock fatale. Il limite di rilevamento del test è al di sopra della soglia della febbre umana. È lungo e costoso e non adatto per nuove importanti aree terapeutiche come i prodotti cellulari. 

Un secondo metodo, condotto ex vivo su campioni ematici di granchi reali (Limulus palyphemus) fu sviluppato negli anni settanta. Anche se la sua portata è limitata tra il 1988 e il 1998 il test sui Limulus ha fatto calare da 78.000 a 9.500 il numero annuale delle analisi su conigli effettuate in Gran Bretagna.

Una comprensione dei meccanismi della reazione umana alla febbre, unita ai progressi nelle tecniche di biologia cellulare, ha spinto allo sviluppo di nuovi test di pirogenicità in vitro utilizzando cellule ematiche umane. Basati sull’attivazione di monociti in risposta ai pirogeni, i nuovi test, ora pienamente avvalorati dall’ECVAM, evitano problemi di specificità delle specie e sono più sensibili, precisi, veloci e produttivi in relazione al costo. Rilevano una più ampia gamma di piroge
ni che il test sui Limulus, e vengono adattati per l’uso con dispositivi medici e di inquinanti atmosferici ambientali; eppure poche persone credevano in precedenza che una funzione complessa come la febbre potesse essere replicata in provetta. La commissione europea stima che più di 200 laboratori in tutto il mondo stiano già mettendo in pratica i metodi in vitro, che sostituiranno ben 200.000 test sui conigli in un anno nella sola Europa.

Nella produzione e controllo di qualità dei vaccini e farmaci biologici, centinaia di migliaia di animali nel mondo sono stati risparmiati dall’introduzione di metodi cellulari. Considerare dei casi storici consente un’analisi più chiara delle cause e dei risultati, in una prospettiva a più lungo termine. Ad esempio, le prove di tossicità residua del vaccino contro la difterite e le prove di efficacia del vaccino contro la febbre gialla: il vecchio test di potenza per il vaccino contro la febbre gialla, che prevedeva l’inoculazione intracerebrale di siero immune e virus nei topi, venne introdotto nel 1950. Questo metodo che implica una dose letale non è stato mai completamente standardizzato e aveva scarsa riproducibilità, attribuita alla differente sensibilità al virus nei topi di diversa età, per le differenze nel processo di introduzione del virus e per il tipo di siero animale utilizzato. A fine anni settanta, un test di coltura cellulare basato sulla formazione di placche per rilevare anticorpi neutralizzanti è stato trovato più pratico, sensibile e riproducibile, sostituendo circa 1.500 topi ogni anno.

Tecniche fisico-chimiche, come i test colorimetrici e la cromatografia liquida ad alte prestazioni, sono stati introdotti come test di controllo della qualità per i farmaci biologici. La digitale era testata di routine per test di potenza su piccioni e cavie, con un metodo che richiede un’iniezione letale endovenosa. Alla fine del 1980, è stato sostituito da un esame chimico colorimetrico che misura direttamente la quantità di digitossina. Analogamente, il metodo delle convulsioni dei topi, in cui ogni lotto di insulina era testato su 600 topi per campione, è stato prima raffinato ed alla fine sostituito dalla cromatografia liquida ad alte prestazioni. Questa è stata introdotta come una tecnica più precisa e accettata come sostituzione dalla British Pharmacopoeia nel 199O. I test cromatografici hanno sostituito anche test biologici sugli animali per l’ormone della crescita, l’ossitocina e la lipressina.

Nella maggior parte degli esempi antecedenti alla fine del 1980, lo sviluppo dei test senza animali è stato spinto dalla insoddisfazione per i test esistenti sugli animali e la necessità di migliorare la precisione, range o riroducibilità. Le tecniche di sostituzione erano anche meno costose e davano risultati più rapidi. Nel caso di cosmetici e prodotti chimici, campagne di consumatori di alto profilo hanno dato la spinta e le direttive europee hanno ora imposto o facilitato la sostituzione di metodi sugli animali. Nell’ultimo decennio la nozione delle Tre R si è molto diffusa è la preoccupazione di risparmiare sofferenze agli animali è diventata una spinta sempre più forte verso altri sforzi per sostituirli.

Le simulazioni al computer nella ricerca medica: fisiologia feto-placentare e ortodonzia

I modelli animali di  fisiologia umana feto-placentare sono di valore limitato, a causa della specificità di caratteristiche delle specie come (1) la struttura placentare, la permeabilità e il flusso sanguigno, (2) le risposte all’ipossia , (3) la vascolarizzazione amniotica, e (4) la composizione e le dinamiche del liquido amniotico. Ciò è particolarmente vero nel caso della sindrome di trasfusione tra gemelli, una grave condizione in cui i gemelli identici ricevono una vascolarizzazione diseguale nell’utero.

I limiti degli studi sugli animali hanno portato allo sviluppo di modelli al computer, basati originariamente sulle misurazioni cliniche dei tassi di crescita del feto, caratteristiche fenotipiche e discordanza di peso, ottenute mediante ultrasuoni. Colour Doppler e Power Doppler di flussi sanguigni e anastomosi vascolari nelle donne in gravidanza hanno fornito ulteriori dati, così anche gli studi su tessuti e organi umani in vitro ed ex vivo, come l’iniezione colorante placentare e la microscopia. 

I primi modelli indicarono le cause di ipertensione indotta dalla gravidanza e preeclampsia. Nel 1995 avevano spiegato con successo il meccanismo alla base del notch diagnostico nel flusso arterioso uterino nelle donne a rischio di preeclampsia. Indivisuando la causa in un’anomalia dell’elasticità della parete arteriosa, le simulazioni al computer hanno annullato l’ipotesi precedente. La modellazione matematica ha anche dimostrato come uno squilibrio in alcune anastomosi nella placenta conduce alla sindrome di trasfusione fra gemelli, rivelando i legami tra trasfusione feto-fetale e squilibrio del liquido amniotico, il segno distintivo della sindrome. Questa scoperta ha portato a un test per predire la predisposizione delle donne e ha fornito un fondamento per classificare la gravità in modo che possano essere selezionati trattamenti ottimali.

I modelli continuano a migliorare e fornire importanti intuizioni sulla fisiologia della gravidanza umana. Essi ora incorporano funzionalità quali gli squilibri del sistema vascolare nel corion, la dinamica dei fluidi fetali, la crescita feto-placentare e le alterazioni circolatorie, l’insufficienza cardiaca fetale e aspetti del sistema renina-angiotensina. Ci si attende che questi sviluppi chiariscano il corso di malattie come la sindrome di trasfusione fra gemelli e contribuiscano a determinare l’efficacia delle terapie in uso e di quelle possibili in futuro.

La Finite Element Analysis ( FE ) è una tecnica presa in prestito dall’ingegneria. Si tratta di un approccio teorico in cui una struttura è modellata matematicamente e suddivisa in una maglia di elementi, delimitata da insiemi di nodi. Si utilizzano porocedure di calcolo per determinare effetti quali tensioni e stress causati da carichi applicati. Questi vengono poi visualizzati per identificare la loro entità e localizzazione precisa nella struttura. Dal 1973, quando è stata introdotta nella ricerca della biomeccanica dentale, l’analisi FE è stata molto utilizzata in studi di materiali dentali, chirurgia orale e maxillo-facciale, ortodonzia, restauri dentali e altro ancora. E ‘utilizzata per prevedere, quantitativamente e in tre dimensioni, le sollecitazioni e le tensioni imposte ai tessuti di denti e mascelle, per contribuire a valutare la sicurezza e l’efficacia di trattamenti e apparecchi dentali. (Vedi fig. 1). 

Sulla base delle note proprietà strutturali dei denti, ossa e legamenti umani, e di materiali odontoiatrici come la ceramica e il titanio, l’analisi FE consente simulazioni dei risultati di trattamenti correttivi, in termini di proprietà di frattura, stress e tensioni a giunzioni, forza di adesione, influenze di carichi termici o meccanici e problemi di rottura.

Un esempio recente è un modello informatico basato sull’analisi FE di una vite in titanio sviluppato per l’impianto nell’osso mascellare come un appoggio per applicare pressione ortodontica. Una simulazione della vite e dell’osso circostante ha previsto la dislocazione provocata da  una pressione correttiva applicata alla vite innestata. Il modello ha mostrato che le tensioni  maggiori sarebbero state al livello del collo della vite e nell’osso al livello della prima filettatura. I risultati suggerivano che la vite avrebbe fornito un’adeguato ancoraggio, e hanno contribuito a indirizzare le decisioni cliniche
per il migliore utilizzo dell’impianto.

Alcuni esperimenti su animali condotti nella ricerca odontoiatrica sono invasivi, a lungo termine e causano rilevanti sofferenze. E comunque, le diversità morfologiche e biomeccaniche tra le specie fanno sì che gli studi sugli animali possano fornire solo un’ “indicazione approssimativa delle probabili conseguenze biomeccaniche nei pazienti “. Per essere otti
mali i modelli FE devono essere avvalorati da e basati su dati umani.

Le simulazioni possono dare conoscenze importanti: per esempio, la modellazione FE di un dente umano e di un legamento sotto carico avvalorata utilizzando i dati di uno studio su volontari umani, ha rivelato che il legamento periodontale era il punto di maggiore sollecitazione. Ciò ha suggerito che la dislocazione iniziale del dente è mediata dal legamento piuttosto che dal rimodellamento cellulare nell’osso. L’ampio uso di simulazioni FE in odontoiatria ha sostituito alcuni esperimenti sugli animali, in particolare nella ricerca di nuovi apparecchi e materiali ortodontici, e nei casi dove ipotesi in competizione sarebbero state altrimenti esaminate utilizzando modelli animali.

La stimolazione magnetica transcranica nella ricerca cerebrale funzionale

La stimolazione magnetica transcranica (TMS) è una tecnica utilizzata nella ricerca cerebrale funzionale che, applicata a volontari umani, è ampiamente accettata come una sostituzione per alcuni esperimenti invasivi su primati non umani. Usando una bobina , la TMS applica alla testa un campo magnetico che inducendo attività neurale casuale interrompe in maniera transitoria e sicura una zona designata del cervello. Questo crea una ‘lesione virtuale’ e ​​durante le decine di millisecondi (o più) di interruzione, i volontari svolgono attività cognitive, visive o altro per determinare l’effetto della ‘lesione’ sulla loro  prestazione normale. Si può quindi dedurre l’ordinaria funzione di quella parte del cervello.

La stimolazione magnetica del sistema nervoso umano era originariamente concepita a metà degli anni Ottanta come una tecnica per la valutazione clinica della funzione nervosa centrale (specialmente la funzione motoria) in pazienti con sclerosi multipla e neuropatia demielinizzante. Il metodo convenzionale utilizzava una dolorosa stimolazione elettrica attraverso la pelle. La stimolazione magnetica, al contrario, era indolore e adatta sia per la valutazione clinica che per la ricerca. La tecnica è stata sviluppata in volontari umani confrontando la stimolazione magnetica e quella elettrica negli stessi individui. Sono stati inoltre condotti anche esperimenti su cani e primati benché non ci fosse la necessità di dimostrarne la sicurezza o per convalidare la tecnica, dal momento che questi studi erano già stati condotti con gli esseri umani .

Le applicazioni di ricerca della TMS si sono da allora estese al di là della funzione motoria per includere l’elaborazione centrale visuale e cognitiva, nonché lo sviluppo e la plasticità corticali. Creando una ‘lesione’ virtuale può dimostrare se un’area del cervello umano è effettivamente necessaria per una certa funzione, o semplicemente correlare l’attività neurale con un risultato, come accade con gli esami di risonanza magnetica funzionale o tomografia a emissione di positroni (PET). 

La TMS unisce buone risoluzioni spaziali e temporali e molti vantaggi nelle ricerche sulle funzioni del cervello. Rispetto agli esperimenti in cui si causano lesioni cerebrali agli animali la TMS è superiore nel fornire una cronologia di attività in diverse aree cerebrali e per la  sul soggetto stesso. Consente l’analisi dell’effetto di una lesione senza la complicazione di riorganizzazione funzionale, che si verifica dopo la lesione cerebrale nei convenzionali esperimenti su animali. La risoluzione spaziale della TMS non è paragonabile con gli esperimenti a livello cellulare che utilizano elettrodi sugli animali. Ma alcuni esperti ritengono che nella ricerca in psicologia cognitiva, per esempio, focalizzata a livello di sistema,  gli studi funzionali sugli umani potrebbero fornire praticamente tutte le informazioni necessarie. Questo sostituirebbe molti esperimenti su primati non umani. Sicura e non invasiva , la TMS ha aperto le porte a una vasta gamma di studi del cervello umano senza le complicazioni dovute alle differenze di specie.

Procedure di sostituzione animale – ulteriori opportunità

Tre aree di ricerca medica – sepsi, malattie respiratorie e dolore – sono state selezionate per mostrare dove siano stati compiuti nella significativi progressi nella sostituzione degli esperimenti sugli animali. In ogni area, gli esperimenti possono comportare grandi sofferenze per gli animali; sono urgentemente necessarie delle innovazioni terapeutiche e la validità dei modelli animali è stata criticata.

La ricerca sulla sepsi

La sepsi è una complessa risposta dell’ospite alle infezioni gravi. Nonostante i notevoli progressi nel trattamento di terapia intensiva e lo sviluppo di antibiotici più efficaci,  la mortalità di questa condizione rimane circa il 20-50 % . Si stima che nel 2004 circa 31000 pazienti siano stati ricoverati in terapia intensiva con la sepsi in Inghilterra, Galles e Irlanda del Nord e  di questi 14.000 siano morti prima delle dimissioni: un tasso di mortalità del 45 % . Vi è una grande bisogno di sviluppare nuove terapie mirate a questa condizione.

Gli animali sono stati ampiamente utilizzati per studiare la fisiopatologia della sepsi , e come modelli per la malattia per testare nuove terapie mentre sono sviluppate. Sono state sviluppate due principali classi di modelli. Composti derivati ​​da microbi, ad esempio il componente lipopolisaccaride batterico, possono essere utilizzati per simulare molte delle caratteristiche della sepsi, e sono fatali a dosi sufficientemente elevate. In alternativa le infezioni sperimentali con microbi vivi sono utilizzate per stabilire l’infezione sistemica e lo sviluppo della sepsi.

Entrambi questi modelli producono grandi cambiamenti fisiologici negli animali utilizzati e in Gran Bretagna possono essere classificati come ‘considerevolmente violenti’ dal Ministero dell’Interno, che regola gli esperimenti sugli animali Modelli animali hanno fornito una grande quantità di prove per stabilire i principali meccanismi fisiopatologici che operano durante la sepsi, e come un trampolino di lancio in sviluppo di nuove terapie. Tuttavia, si tratta di modelli imperfetti. Vi sono importanti differenze nelle risposte dei diversi animali, esseri umani inclusi, alla sepsi.  Ad esempio, i roditori, la specie più utilizzata in tali lavori, sono circa 1000 volte più resistenti agli effetti tossici del lipopolisaccaride rispetto agli esseri umani. Inoltre, un numero elevato di trattamenti sperimentali di alto profilo ha funzionato bene in modelli animali ma è stato bocciati nelle sperimentazioni cliniche.

Alla luce di queste preoccupazioni etiche e scientifiche, si vede la necessità di sostituire e perfezionare modelli animali nello studio della sepsi, sia per ridurre la sofferenza degli animali che per migliorare la capacità predittiva dei modelli per lo sviluppo di nuove terapie per la sepsi umana. La natura complessa della sepsi rappresenta una vera sfida per sviluppare alternative alla sperimentazione animale che fornirà significative informazioni biologiche. Tuttavia, data la mancanza di successo dei modelli animali di sepsi nel predire risultati nell’essere umano vi è una reale necessità di sviluppare migliori modelli di predizione. Vi sono molti approcci che fanno ben sperare per il futuro.

Gli strumenti in vitro della biologia molecolare e cellulare forniranno ancora molte informazioni importanti in futuro. La capacità di manipolare tali sistemi in modo controllato permette di trarre solide deduzioni da trarre e testare nuove ipotesi. Nuovi metodi di coltura cellulare che usano supporti tridimensionali fanno ben sperare come modelli migliori per le funzioni dei tessuti (vedi fig. 2), e progressi della biologia delle cellule staminali potrebbero consentire la fabbricazione interamente in vitro di tessuti complessi. Allo stesso modo, il progresso compiuto nella modellazione al computer della sepsi può anche permettere modellizzazione di processi settici senza l’uso di animali.

Gli ultimi 50 anni hanno visto un notevole calo nel campo della sperimentazione clinica con soggetti umani. Bench�
� benvenuto, l’aumento di controllo sugli studi umani ha portato a quanto pare ad un calo di tali approcci, sia su pazienti viventi che su materiale rimosso per successiva analisi in vitro.   Entrambi questi approcci possono gettare luce considerevole sulla fisiopatologia della sepsi. Ad esempio, gli studi che esaminano il flusso sanguigno in volontari umani hanno indagato la venodilatazione alla base dei meccanismi che seguono la somministrazione di citochine, mettendo in luce il ruolo dell’ossido di azoto negli esseri umani viventi. 

Un importante studio ha usato biopsie di bambini con sepsi meningococcica per studiare il ruolo della proteina C anticoagulante nella sepsi. La scoperta che l’attivazione endoteliale della proteina C era compromessa in questo contesto ha contribuito a sostenere lo sviluppo della proteina C attivata come terapia per la sepsi con alcuni benefici dimostrabili. Questo è un esempio concreto in cui dati derivati ​​direttamente da studi sull’essere umano hanno aiutato nello sviluppo di una terapia utile. Allo stesso modo, biopsie muscolari prelevati da pazienti settici hanno dimostrato una grave disfunzione  mitocondriale, suggerendo nuovi obiettivi per l’intervento terapeutico. Un maggiore uso di soggetti umani e materiale nella ricerca sulla sepsi potrebbe contribuire alla riduzione della sperimentazione animale, fornendo approfondimenti meccanicistici in questo grave problema medico.

La ricerca sulle malattie respiratorie

La maggior parte delle malattie che colpiscono i polmoni è di origine ambientale, prodotta da meccanismi infettivi, immunologici o tossicologici.

L’estensione delle vie respiratorie dell’epitelio alveolare, che ha la superficie di un campo da tennis, fornisce l’interfaccia tra l’ambiente esterno e il milieu di tessuto interno, che se affetto da disturbi porta a danni tissutali e malattie. L’epitelio svolge una funzione di barriera, fisicamente respingendo insulti ambientali, e funzionalmente attraverso il rilascio di diverse molecole bioattive e una gamma di attività metaboliche per inattivare o proteggere da agenti chimici.

Sono necessari nuovi agenti terapeutici per l’asma e broncopneumopatia cronica ostruttiva (BPCO), ma i modelli animali sono limitati a causa delle differenze strutturali e fisiologiche nelle vie respiratorie di topi e umani. Queste due malattie sono buoni esempi di disturbi associati all’ambiente che si rivelano attraverso un’accresciuta suscettibilità genetica e una serie di insulti ambientali es. fumo di tabacco, allergeni, sostanze chimiche e agenti infettivi. In entrambe le malattie, ci sono grandi differenze nella struttura e nella funzione dell’epitelio. L’epitelio rivela anche molti geni di suscettibilità candidati per queste malattie, identificati dalla clonazione posizionale. Per esempio, nell’ asma è stata trovata una forte associazione con polimorfismi di diversi geni che sono preferenzialmente espressi nell’epitelio.

Basandosi su interazioni gene-ambientali è stato possibile riprodurre alcune delle caratteristiche dell’asma e BPCO utilizzando l’ingegneria dei tessuti. Le cellule epiteliali rimosse dalle vie respiratorie di volontari con una broncoscopia a fibre ottiche possono essere coltivate a confluire in una coltura tissutale per 2-3 settimane. Queste forniscono una risorsa per investigare le caratteristiche basali e le risposte all’esposizione a stimoli pertinenti, es. inquinanti atmosferici , fumo di tabacco, virus. L’epitelio ricostituito in vitro da pazienti asmatici presenta un’aumento della permeabilità a causa della ridotta formazione di giunzioni occludenti e della suscettibilità alle sostanze inquinanti ossidanti. È anche più sensibile ai danni di virus del raffreddore comune (a causa della ridotta produzione di β  e λ interferone).

Nel caso della BPCO le cellule epiteliali al basale in seguito all’esposizione di estratto di fumo di tabacco presentano anche marcatori di danno e riparazione che si verificano in vitro nelle cellule respiratorie dei pazienti, ma non in quelli da volontari normali. Anche il profilo di geni ossidanti protettivi espressa dalle cellule epiteliali di pazienti con BPCO al basale e quando esposte all’estratto di  fumo di tabacco è correlato alla gravità della malattia in vivo. Come nell’asma, anche le cellule epiteliali coltivate di pazienti con BPCO mostrano una maggiore sensibilità agli effetti dannosi di virus del raffreddore comune che potrebbe spiegare perché tali pazienti siano più vulnerabili alle esacerbazioni indotte da virus. In entrambe le condizioni, i fenotipi correlati alla malattia persistono per più passaggi nella cultura tissutale, il che suggerisce che essi siano anomalie primarie piuttosto che secondarie.

Sulla base del sistema monostrato in vitro, è stato possibile produrre un epitelio delle vie respiratorie completamente differenziato coltivando le cellule su inserti, e dopo che esse hanno formato dei monostrati portando le cellule fino all’interfaccia aria/liquido. Con la rimozione dei fattori di crescita e aggiunta di acido retinoico, queste cellule si differenziano dopo 3-4 settimane in un epitelio pienamente stratificato con cellule ciliate funzionali che secernono muco calice. Se coltivate in presenza della citochina pro-asmatica IL-13, una percentuale elevata di cellule colonnari si trasforma in cellule caliciformi con evidenza di secrezione attiva di muco. Le cellule epiteliali differenziate coltivate da vie respiratorie asmatiche si comportano in modo diverso da quelli delle vie respiratorie normali: la  formazione di giunzioni occludenti è carente, c’è una parallela riduzione della resistenza elettrica transepiteliale che indica un epitelio più ‘disperdente’ ( STH , osservazioni non pubblicate). 

Poiché questi sistemi di coltura cellulare mantengono caratteristiche dei fenotipi della malattia, possono essere utilizzati per cercare nuovi bersagli molecolari che utilizzino piattaforme genomiche e proteomiche. Possono anche essere utilizzati come sistemi di test per nuove terapie come l’interferone-beta ricombinante umano nel ripristinare la resistenza al virus del raffreddore comune. Considerati nell’insieme, questi studi forniscono un solido fondamento per l’utilizzo di colture respiratorie epiteliali provenienti da pazienti ben fenotipizzati, per scoprire nuovi obiettivi terapeutici e testare nuove terapie per queste patologie in cui vi è un urgente bisogno di maggiore innovazione. Le simulazioni al computer sono state utilizzate anche per esplorare meccanismi di patologia asmatica e predire l’efficacia di trattamenti potenziali, contribuendo ulteriormente a sostituire alcuni esperimenti sugli animali.

La ricerca sul dolore

Il dolore può solo essere descritto e confermato nell’essere umano in termini di un’ esperienza integrata che è sensoriale, affettiva e motivazionale. Sebbene la maggior parte del dolore è generato dalla attivazione di terminazioni nervose specializzate (nocicettori), il dolore può anche derivare da danni al sistema nervoso o di stress psicologico.

Esperimenti di imaging funzionale del cervello su volontari hanno dimostrato una matrice di centri corticali superiori implicati nell’insieme dell’integrazione cognitiva che si traduce in dolore. Alcuni di questi centri superiori, come ad esempio la corteccia cingolata, sono scarsamente sviluppati in molti non-primati. 

Esperimenti di imaging funzionale del cervello su volontari hanno dimostrato una matrice di centri corticali superiori implicati nell’insieme dell’integrazione cognitiva che si traduce in dolore. Alcuni di questi centri superiori, come ad esempio la corteccia cingolata, sono scarsamente sviluppati in molti non-primati. 

Il presupposto che le scoperte possano essere facilmente trasferite da una specie all’altra è messa in discussione da un lungo elenco di farmaci che sono efficaci nel ridurre le risposte nocicettive negli animali, ma non sono riusciti come analgesici negli studi clinici. La sfida ora è quella di determinare come possiamo sviluppare analgesici nuovi e
sicuri più efficientemente. 

I modelli animali ci hanno fornito informazioni chiave sulle connessioni anatomiche dettagliate dei percorsi nocicettivi e dei potenziali meccanismi fisiologici della percezione del dolore. Tuttavia, l’attenzione degli studi sugli animali e stata  posta sulla nocicezione (sensibilità dei nocicettori agli stimoli dolorosi) in di strutture alla fine del tronco cerebrale. I modelli animali di dolore sono stati molto riesaminati di recente. In generale, viene osservato il comportamento degli animali o sono registrate le risposte nel sistema nervoso, mentre uno stimolo nocivo viene applicato prima e dopo qualche tipo di intervento fisiologico. Il problema principale con l’interpretazione di modelli animali è che le osservazioni comportamentali sono limitate a risposte motorie e queste non possono essere facilmente ricondotte ad un cambiamento della sensazione del dolore. I modelli di dolore degli animali possono pertanto produrre solo alcuni possibili indizi per meccanismi potenziali del dolore negli esseri umani.

Il dolore viene percepito come il risultato dell’attività integrata di strutture cerebrali ben definite e vi sono due sistemi principali: centrale e periferico. Studi di imaging funzionale cerebrale su umani hanno fornito informazioni essenziali su come queste strutture contribuiscano alla percezione del dolore umano normale e anormale in volontari e pazienti. (Vedi fig. 3). Per esempio, gli studi PET che misurano indirettamente l’attività sinaptica nel cervello sono stati utilizzati per stabilire che i sistemi del dolore mediale e laterale sono principalmente  coinvolti rispettivamente con l’elaborazione di dolore emotivo (ad esempio sgradevolezza) e l’elaborazione sensoriale-discriminante (ad esempio la localizzazione del dolore). Utilizzando una diversa tecnica PET che rappresenta il legame dei recettori sui neuroni, è stato possibile misurare variazioni nell’attività di antidolorifici naturali chiamati endorfine, in diversi tipi di dolore cronico. Fra gli approcci complementari l’analisi dei tessuti post mortem, che fornisce un”istantanea’ delle differenze chimiche nei neuroni periferici e centrali (es. midollo spinale), in relazione ad anomalie sensoriali nei pazienti con dolore dovuto a un danno nervoso.

La sfida è di usare questi diversi tipi di informazioni per sviluppare nuove terapie per il dolore in modo più efficace. Suggeriamo alcuni approcci per raggiungere questo obiettivo. In primo luogo, occorre passare dalla classificazione del dolore in base all’anatomia, alla malattia e al tempo  ad una definizione più fisiologica di sindrome da dolore clinico, facendo uso di metodi fisiologici come tecniche di imaging cerebrale funzionale. Ciò può essere ottenuto mediante l’accurata misurazione fisiologica e psicologica in pazienti con diversi tipi di sindrome da dolore. Per esempio, abbiamo (AJ) recentemente identificato una incapacità di modificare la reazione al dolore in pazienti con un tipo di dolore cronico diffuso chiamato fibromialgia.

Per raggiungere un approccio più fisiologico di classificazione del dolore sarà necessario identificare i normali meccanismi fisiologici e fisiopatologici della percezione del dolore. Per esempio, studi PET hanno mostrato una riduzione selettiva dei recettori per gli oppiacei naturali nel cervello di pazienti con forti dolori causati da ictus. Tali studi richiedono investimenti consistenti e una maggiore collaborazione tra l’industria farmaceutica e del mondo accademico. In seguito all’individuazione dei meccanismi negli esseri umani, lo sviluppo di farmaci mirati dovrebbe essere strettamente basato sull’adattamento di questi meccanismi. Dopo aver individuato e misurato i meccanismi fisiopatologici, i prototipi delle sperimentazioni saranno molto più produttivi in relazione al costo. Sarebbe ideale che nessun farmaco venga sviluppato senza aver dimostrato prima dei test clinici che esso raggiungerà l’organo bersaglio nell’essere umano. In molti casi ciò si può ottenere utilizzando l’imaging molecolare, ad esempio la PET.

Riassumendo, esistono le tecniche per cominciare a riclassificare il dolore umano fisiologicamente e per identificare meccanismi fisiopatologici candidati nei volontari. Risalendo da questi meccanismi allo sviluppo di farmaci, si possono sostituire alcuni esperimenti sugli animali. Questo non è al di là delle capacità attuali di imaging molecolare, ma richiederà un profondo cambiamento nel modo di pensare al dolore.

Cosa c’è da fare adesso?

Storicamente l’impulso di sostituire le procedure sugli animali ha coinvolto aspetti umani e scientifici, ed è ancora così. Il riconoscimento della capacità degli animali di provare dolore e angoscia fornisce un impulso crescente per il progresso, più evidente nei test normativi in cui lo sviluppo di metodi senza animali è stato abbracciato da tossicologi, legislatori e regolatori. Singoli scienziati preoccupati per l’uso degli animali hanno avuto un impatto significativo in particolari settori, come la sperimentazione di vaccini. 

L’insoddisfazione per la qualità dei dati ricavati dagli animali resta una forte motivazione per il cambiamento, e la ricerca di alternative superiori sta attirando sempre fondi governativi. La Commissione europea sta supportando un programma di ricerca per sostituire tossicologia basata sugli animali facendosi promotore di un contributo alla qualità della scienza e la sicurezza dei consumatori, prevenendo allo stesso tempo la sofferenza degli animali.

Nel mondo accademico, dove l’accento va più sulla la ricerca medica fondamentale, il cambiamento è stato più lento. Ci sono diversi motivi: (1) le domande di ricerca aperte sono considerate  più difficili da perseguire senza esperimenti su animali, (2) vi sono poche vie per esercitare la pressione dei consumatori e (3) la ricerca accademica è meno definita da iniziative legislative e normative. Tuttavia, la recente riconsiderazione sistematica di come la ricerca sugli animali si traduca o meno in un beneficio clinico può ben indicare un cambiamento.

Diverse fra tali critiche hanno dimostrato che gli studi sugli animali sono stati scarsamente predittivi di esiti umani. In particolare, sono state trovate discordanze fra dati umani e animali per (1) corticosteroidi nelle lesioni alla testa, (2) anti-fibrinolitici nel sanguinamento, (3) tirilazad per l’ictus e (4)  farmaci neuroprotettivi nell’ictus.

Una revisione sistematica di studi su animali molto citati pubblicati in sette pubblicazioni scientifiche leader, ha rilevato che solo il 37% di questi hanno portato a sperimentazione umana di successo. Una delle domande cruciali in questi e altri articoli è se i modelli animali imitino le malattie umane ad un grado sufficiente.

Il cambiamento è in arrivo. Sviluppi legislativi, come il nuovo quadro normativo di gestione delle sostanze chimiche (regolamento REACH, ndt), e la revisione della normativa europea in materia di spementazione animale, potrebbero accellerare il passo. L’impressione che la ricerca per sostituire gli animali sia un settore di nicchia è stata superata, e possibilmente il concetto di sostituzione sarà supportata su pubblicazioni scientifiche tradizionali. Negli Stati Uniti il comitato di coordinamento interistituzionale sulla convalida di metodi alternativi (ICCVAM) ha appena elaborato un piano quinquennale per lo sviluppo e convalida di metodi alternativi alla sperimentazione animale; il Giappone ha istituito un centro di metodi alternativi nel 2005. Grandi finanziatori come la Wellcome Trust stanno timidamente muovendo i loro primi passi per sostenere questa ricerca. Organizzazioni influenti come la Royal Society e il Nuffield Council on Bioethics nelle loro pubblicazioni riconoscono sempre più i limiti dei dati animali nella ricerca medica.

Sostituire gli esperimenti sugli animali è una sfida culturale che richiede flessibilità e apertura a nuove idee, e una sfida scientifica che necessita di un fresco approccio interdisciplinare. La ricerca di cui si ha bisogno ha anche il potenz
iale per dare una spinta alla scienza, migliorare il progresso medico e proteggere meglio la sicurezza dei pazienti e dei consumatori.

 

Ringraziamenti

Siamo molto grati per l’assistenza data da Nevil Chimon e
Alison Watson, e di Georges Limbert e John Middleton
per il permesso di riprodurre la figura 1.

 

Figura 1

La simulazione basata sull’analisi tridimensionale a elementi finiti dell’adattamento di un osso attorno a un impianto a vite. La scala colorata rappresenta le variazioni previste nella densità ossea in risposta all’impianto. La dnsità è direttamente correlata alla resistenza ossea e,  dopo l’inserimento dell’impianto, si sviluppa in un processo di danno/riparazione che continua fino al raggiungimento di un equilibrio meccanobiologico. Le simulazioni al computer possono dare una comprensione approfondita di meccanismi di feedback complessi e dei vari parametri coinvolti, predicendo il tasso di osteointegrazione e quindi la durata dell’impianto, nei successivi 80 giorni. Con il permesso di Georges Limbert e John Middleton.

Figura 2.
Tubulo renale coltivato in vitro.

Cellule epiteliali primarie del tubulo renale umano sono state coltivate in una matrice di collagene tridimensionale in presenza del fattore di crescita degli epatociti per incoraggiare la tubulogenesi. Le cellule sono state fissate e colorate per la proteina actina-associata ezrin (verde ) che è concentrata nel bordo a spazzola (frecce) rivolto verso un lumen tubolare centrale (L). Tali colture cellulari tridimensionali possono essere
utilizzate per studiare i danni tissutali nella sepsi . Scala bar 100 µm.

Figura 3.
Le sezioni di aree cerebrali di 4 e 6 mm che dimostrano una maggiore attivazione nelle aree del sistema di dolore mediale in pazienti (AP) con una condizione di dolore artritico (AP-EP), rispetto alla condizione (EP-AP) di dolore sperimentale (EP).

 pAcc, corteccia cingolata anteriore perigenuale; aMcc, corteccia cingolata anteriore; PCC, corteccia cingolata posteriore; SGC, corteccia cingolata subgenuale.

Fermare la SA significa… andare avanti con la Ricerca!

Recentemente l’esponente di un gruppo pro-SA è stato intervistato sul tema dei test sugli animali, commettendo diversi errori che andremo ad analizzare.

Ad esempio, per quanto riguarda la legge che si appresta ad essere attuata, afferma:

“Il divieto di utilizzo degli animali per gli xenotrapianti impedisce diverse ricerche sul cancro (ad esempio quelle nelle quali le cellule di un tumore umano vengono impiantate in un topo per potere testare le migliori terapie da utilizzare per curare il paziente), impedisce le ricerche sulle valvole cardiache biologiche, che permettono a milioni di persone con problemi cardiaci di vivere una vita normale”

In realtà, prima ancora di disquisire sulla mancanza di predittività degli attuali modelli murini di cancro, ci preme far notare come in Parlamento siano stati molto chiari che il divieto di xenotrapianti non si estenda a cellule e tessuti ma esclusivamente ad organi interi, pertanto gli esempi citati non sono inclusi.
Ciò è stato inoltre confermato dal Ministro della Salute Lorenzin.

Continua:

“e impedisce di portare avanti ricerche innovative che hanno la potenzialità di risolvere definitivamente il problema delle liste di attesa dei trapianti”

In realtà gli xenotrapianti di organi interi hanno dato risultati estremamente fallimentari, ricordiamo il caso di Baby Fae, morta 21 giorni dopo che le fu trapiantato il cuore di un babbuino, o ancora, più recentemente, il tragico xenotrapianto di fegato effettuato da Starzl e colleghi, che provocò al paziente le seguenti condizioni: ingrossamento del fegato ad una dimensione che superava il doppio di quella iniziale, infezioni, emorragie gastrointestinali, trasfusione di sangue, insufficienza renale, dipendenza da dialisi, tossicità multipla da farmaci, perdita improvvisa delle maggiori funzioni del sistema nervoso, emorragia subaracnoidea e morte [1]. In aggiunta, nonostante i numerosi fondi spesi in questo campo, ancora sussistono numerose barriere che rendono insicuri gli xenotrapianti. Ad esempio, nonostante si siano ridotte le probabilità di imbattersi nel rigetto iperacuto, il problema del rigetto umorale acuto continua a persistere. [11].

Ci chiediamo quindi perchè invece non focalizzarsi su di una reale innovazione che potrebbe porre fine alla mancanza di organi in tutto il mondo e ai problemi di rigetto, ovvero quella di stampare organi in 3D partendo da cellule staminali, progetto a cui stanno già lavorando i ricercatori della Heriot-Watt University. Un giorno, si spera, sarà possibile “stampare” veri e propri organi, da utilizzare per esempio per i trapianti, mentre il traguardo più vicino è quello di ottenere tessuti da utilizzare nella ricerca tossicologica o nello ricerca e sviluppo di nuovi farmaci. 
Ricordiamo che per la ricerca tossicologica, il modello maggiormente utilizzato è purtroppo quello animale. A questo proposito, i ricercatori sostengono che: “[…] current analysis of potential metabolite toxicity involves the use of a large number of experimental animals (mostly rodents). This is not ideal as animal models are both costly to run and less likely to give an accurate representation of metabolism and toxicity in the human organ. Ongoing model development also seeks to reduce the number of animals used in such work for ethical reasons” [2].

Tornando all’intervista, i pro-SA aggiungono:

“se devo studiare un’interazione preliminare tra cellule diverse posso pensare di utilizzare un system-on-a-chip oppure un bioreattore multi-compartimentale, ma se voglio studiare la cinetica di un farmaco, il suo metodo di eliminazione ed escrezione oppure se voglio studiare un sistema complesso come il cervello, si deve utilizzare assolutamente un animale.”

In realtà le funzioni dei Bioreattori Multicompartimentali Modulari non sono così ristrette, infatti andando a vedere sul sito dei produttori notiamo come tra le applicazioni del metodo vengano inclusi gli “ADME studies“. ADME, lo spieghiamo per chi non lo sapesse, è l’acronimo di Assorbimento, Distribuzione, Metabolismo ed Eliminazione/Escrezione, dunque non si capisce perchè gli studi di farmacocinetica e di escrezione non avrebbero, secondo l’intervistato, alternativa alcuna agli animali, dato che inoltre gli stessi produttori hanno descritto il loro modello come un possibile Replacement dei test su animali.

Sempre per quanto riguarda i Bioreattori Multicompartimentali, riportiamo da una pubblicazione in proposito i possibili utilizzi del modello, che, grazie all’interconnessione di più camere e al passaggio di un fluido che simula la circolazione sanguigna, si estendono allo studio del metabolismo e di alcune malattie:

“We have suggested that this induction is due to two factors: the circulation of medium which provides a sustainable supply of nutrients, as well as efficient removal of metabolic products, and the mechanical stimulus due to the presence of a low velocity porous or percolative interstitial-like flow which is established through the collagen coating (Vinci et al., 2009). […] In addition, the bioreactor chambers can be connected together in series or in parallel as desired, using different cell types, tissue slices, or scaffolds in order to recreate in vitro models of metabolism or diseases.” [3]

Per quanto riguarda invece i lab-on-a-chip, anche qui l’intento è il Replacement degli animali nei test, come è possibile notare visionando il video in proposito del Wyss Institute di Harvard, creatore degli organs-on-a-chip. 

Inoltre esistono le “cells-on-a-chip” [4], in grado di studiare la farmacocinetica e la farmacodinamica, e sono in via di sviluppo ulteriori modelli su chip per lo studio dell’ADME [5].

Un ultimo progetto “on-a-chip” molto interessante è quello del “body-on-a-chip”, un sistema che interconnetterà i vari “organs-on-a-chip”, la cui applicazione sarà nel campo dello sviluppo dei farmaci, dei test di sicurezza delle sostanze chimiche, e della modellazione di molte malattie.

Infine, nell’ampissimo campo della ricerca sul cervello, rimandiamo ai nostri articoli in proposito, di certo non esaustivi nell’esplicitare l’ampia mole di metodologie alternative in questo ambito (1, 2, 3, 4, 5, 6).

Continua il pro-SA:

“la quasi totalità della comunità scientifica, secondo un recente sondaggio effettuato da
Nature, reputa che la sperimentazione animale sia fondamentale ed insostituibile. “

In realtà il sondaggio in questione, Animal research: Battle scars, faceva notare come il 70,3% dei rispondenti facesse SA. Pertanto quanto può essere credibile un sondaggio in cui la quasi totalità degli intervistati ha conflitti di interessi?

“Se viene spiegato alla gente comune che il sacrificio di alcuni animali (per stragrande maggioranza topi o ratti) è quello che ha permesso l’allungamento della vita, la riduzione della mortalità infantile e la sconfitta di diverse malattie che una volta decimavano la popolazione, la loro opinione cambia”

In realtà dovremmo dir loro che è grazie a volontari clinici umani che abbiamo avuto questi risultati. Potremmo dir loro che siano stati gli animali solo nel caso in cui il risultato che dà l’animale corrispondesse nella stragrande maggioranza a quello che dà l’uomo, ma non è così. Ovviamente più fondi vengono impiegati verso una metodologia, più anche l’eccezione (vale a dire le volte in cui umano e animale correlano) diventa ampia e visibile; dovremmo però contare che lo diventa anche il numero dei fallimenti che di norma non vengono invece presi in considerazione.

“Sono ovviamente ben accetti e di norma quando esiste un metodo affidabile che non impiega animali questo viene immediatamente utilizzato.”

Sbagliato, un metodo alternativo per essere accettato deve essere approvato dall’ECVAM, che impiega svariati anni per ogni singola metodologia, ed essere inserito nelle linee guida. Questo significa che vi sono moltissimi metodi alternativi che per motivi di burocrazia non possono essere utilizzati, nonostante esistano e possano ad oggi sostituire l’animale in diversi campi.

“Il numero di farmaci veramente dannosi è irrisorio e lo dimostra lo 0.0005% di decessi e lo 0.02% di effetti collaterali gravi che si vedono negli studi clinici di fase I (quando si testa per la prima volta un farmaco sull’uomo): se la fase preclinica su animali fosse inutile questi numeri sarebbero decisamente maggiori.”

In realtà molti effetti avversi non si manifestano nelle prime fasi cliniche a causa delle dosi. 
Infatti, i livelli posologici da cui si iniziano i test nell’uomo sono di solito 1/100 della dose NOAEL (No Observed Adverse Affect Level), cioè della dose massima alla quale, nell’animale, non si sono verificati effetti collaterali di sorta. 
Il dosaggio iniziale verrà poi aumentato progressivamente, rivelando spesso anche tutti gli effetti avversi che non si erano rilevati in precedenza a causa della dose minore. 
Ciò è dimostrato dal fatto che ben l’81% delle volte gli animali non riescono a predire i gravi effetti avversi ai farmaci in post-marketing per l’uomo [6].
Oltre a ciò, partire da una dose che sia più bassa di quella animale è già una conferma di per sé della mancanza di attendibilità della SA. Infatti, quale prova migliore del fatto che i dati ottenuti sull’animale non siano predittivi per l’uomo e che le fasi cliniche attualmente rappresentino un salto nel vuoto senza alcuna reale protezione?

Inoltre, uno studio del 2005 di Horstmann e colleghi esaminò i trial di fase I per terapie antitumorali, scoprendo che nei trial relativi a singoli agenti chemioterapici si erano verificati eventi tossici seri ma non fatali in circa il 15 per cento dei soggetti e vi erano state 58 morti. Riportiamo le loro conclusioni:

“In conclusione, l’affidamento ad una singola stima del tasso di risposta o del tasso di mortalità correlato alla tossicità per la fase 1 dei trial oncologici è fuorviante, dal momento che i tassi di risposta e la tossicità variano a seconda del tipo di prova. I potenziali partecipanti e le loro famiglie, gli oncologi, i ricercatori, i membri di comitati etici, gli esperti di etica, e altri interessati a pesare i rischi e i benefici degli studi di fase 1 e a prendere decisioni sulla loro accettabilità devono essere consapevoli della complessità e della varietà di tali prove, conoscere i dettagli circa il trial che stanno prendendo in considerazione, e valutare attentamente tutti i rilevanti rischi e benefici” [7]

Per maggiori informazioni in proposito, rimandiamo al nostro approfondimento sulla fase I.

Il pro-SA continua:

“Infatti chi sostiene queste tesi “dimentica” (volutamente?) di dire che quegli stessi farmaci sono stati testati con successo nelle colture cellulari in vitro e che, se sono stati commercializzati, sono stati anche testati con successo anche nell’uomo.”

Per quanto riguarda i test in vitro, la quasi totalità che viene usata in fase preclinica è con cellule animali, per test più accurati dovremmo sostituirle con corrispettive umane [8]. E’ stato infatti chiaramente dimostrato che le marcate differenze di specie osservate su animali possono essere riprodotte nei modelli di coltura che utilizzino tessuti o cellule di altre specie [9]. Nonostante ciò, la direttiva europea 2010/63/UE, afferma: “I tessuti e gli organi animali sono impiegati per lo svi­luppo di metodi in vitro”. 
In aggiunta, dato che i correnti metodi pre-clinici in vitro sono le colture di cellule 2D, non in grado di ricapitolare la risposta umana in vivo, sarebbe doveroso sostituirle con modelli di tessuti o cellule 3D [10]. 
Infine, sarebbero da applicare i modelli in vitro multi-organo e multi-compartimentali, in grado di ricapitolare al meglio le interazioni organo-organo che avvengono in vivo.

Per quanto riguarda i fallimenti in fase clinica, vi è una piccola contraddizione: se i fallimenti dei modelli in vitro, giustamente inadeguati così come attualmente concepiti e da sostituire così come i successivi test in vivo, devono essere contati assieme al fallimento del modello animale, perchè, nella valutazione dei test su animali, non dovrebbe essere contato anche il fallimento nelle successive fasi cliniche oltre allo scarto che si ha dalla SA alla fase I? 

Ovviamente vi è un grande fallimento anche per quanto riguarda i trial clinici, ma ciò non fa altro che confermare la sfiducia nel modello animale. Infatti, se già differenze genetiche intra-specifiche di appena lo 0,1% portano a grandi insuccessi, cosa dovremmo ricavare da esseri che differiscono da noi per il 2 o il 15% di DNA?

“Il problema è dovuto alla complessità degli organismi viventi, alla rarità dell’effetto collaterale in questione (che magari avrebbe avuto bisogno di un numero molto più alto di animali in fase preclinica e di molti più pazienti nei trial clinici per essere visualizzabile)”

In realtà agli animali vengano somministrate dosi elevate e per lunghi periodi, proprio allo scopo di far emergere anche i potenziali effetti collaterali rari, quindi se non emergono ciò è da considerarsi un vero e proprio fiasco, dato che, se non funzionano, perché si fanno? E se dovrebbero funzionare, perché mai questo non sarebbe considerabile un fallimento? 

Riporto infatti da una pubblicazione, che afferma:

“One could argue that non-clinical studies are not designed to identify rare adverse reactions that appear after market approval.
Although the number of animals used in non-clinical studies is relatively small, the studies are designed to find important side effects that are likely to occur in humans (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 2009). However, as high doses are administered for a prolonged period to elicit a complete toxicological response in animals, this approach can also estimate potential toxicities that could occur in humans.” [6]

Ovviamente, dato che nell’81% dei casi gli
animali non riescono a identificare i gravi effetti avversi ai farmaci, si capisce bene che il problema non è in come è strutturato il test, ma semmai nella differenza tra uomo e animale.

Fonti: 

[1] Starzl TE, Fung J, Tzakis A, Todo S, Demetris AJ, Marino IR, Doyle H, Zeevi A, Warty V, Michaels M, et al. Baboon-to-human liver transplantation. Lancet. 1993 Jan 9;341(8837):65-71.

[2] http://www.genengnews.com/gen-articles/organ-printing-from-stem-cells/4171/

[3] Mazzei D, Guzzardi MA, Giusti S, Ahluwalia A. A low shear stress modular bioreactor for connected cell culture under high flow rates. Biotechnol Bioeng. 2010 May 1;106(1):127-37.

[4] Sung JH, Esch MB, Shuler ML. Integration of in silico and in vitro platforms for pharmacokinetic-pharmacodynamic modeling. Expert Opin Drug Metab Toxicol. 2010 Sep;6(9):1063-81.

[5] Kimura H, Yamamoto T, Sakai H, Sakai Y, Fujii T. An integrated microfluidic system for long-term perfusion culture and on-line monitoring of intestinal tissue models. Lab Chip. 2008 May;8(5):741-6.

[6] van Meer PJ, Kooijman M, Gispen-de Wied CC, Moors EH, Schellekens H. The ability of animal studies to detect serious post marketing adverse events is limited. Regul Toxicol Pharmacol. 2012 Dec;64(3):345-9.

[7] Horstmann E, McCabe MS, Grochow L, Yamamoto S, Rubinstein L, Budd T, Shoemaker D, Emanuel EJ, Grady C. Risks and benefits of phase 1 oncology trials, 1991 through 2002. N Engl J Med. 2005 Mar 3;352(9):895-904.

[8] Bunton D. The use of functional human tissues in drug development. Cell Tissue Bank. 2011 Feb;12(1):31-2. doi: 10.1007/s10561-010-9213-5. Epub 2010 Sep 8.

[9] Zeilinger K, Sauer IM, Pless G, Strobel C, Rudzitis J, Wang A, Nüssler AK, Grebe A, Mao L, Auth SH, Unger J, Neuhaus P, Gerlach JC. Three-dimensional co-culture of primary human liver cells in bioreactors for in vitro drug studies: effects of the initial cell quality on the long-term maintenance of hepatocyte-specific functions. Altern Lab Anim. 2002 Sep-Oct;30(5):525-38.

[10] Teresa M. DesRochers, Laura Suter, Adrian Roth, David L. Kaplan. Bioengineered 3D Human Kidney Tissue, a Platform for the Determination of Nephrotoxicity. PLoS One. 2013; 8(3): e59219. PMCID: PMC3597621.

[11] “[…] Further advances are required to overcome the remaining barriers.
[…] AHXR may occur despite the administration of pharmacologic immunosuppressive agents, and is particularly seen following the development of a T-cell-dependent elicited antibody response.”

Ekser B, Cooper DK. Overcoming the barriers to xenotransplantation: prospects for the future. Expert Rev Clin Immunol. 2010 Mar;6(2):219-30.