Archivi del mese: settembre 2013

Problemi della Ricerca Traslazionale con Animali

[Martić-Kehl MI, Schibli R, Schubiger PA. Can animal data predict human outcome? Problems and pitfalls of translational animal research. Eur J Nucl Med Mol Imaging. 2012 Sep;39(9):1492-6. doi: 10.1007/s00259-012-2175-z.]

Full Text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3411287/

Introduzione:

I modelli animali sono creduti predittivi per lo sviluppo di farmaci nella cura della salute umana. Mentre gli studi di DL50 di candidati farmaci sono sempre stati eseguiti in animali come roditori o cani, gli studi di efficacia e di effetti avversi che utilizzano animali come modello per gli esseri umani sono stati richiesti solo alla fine del 1950, come conseguenza dello scandalo talidomide, dove migliaia di bambini sono nati con gravi deformazioni agli arti.

Negli ultimi 10-15 anni, le metodologie di ricerca precliniche sono aumentate crucialmente per quanto riguarda la misurazione della sensibilità e della specificità. Adattate e migliorate per l’ uso dedicato alla ricerca su animali, la tomografia ad emissione di positroni (PET) e la tomografia computerizzata a emissione di singolo fotone (SPECT) sono buoni esempi di tali metodologie . Ci sembra che una maggiore precisione della misura nella ricerca animale ha in qualche modo aumentato le aspettative per quanto riguarda la previsione dell’esito umano di dati preclinici.

Negli ultimi anni, invece, vi è stato un crescente scetticismo sull’essenzialità dei modelli animali per il progresso medico [1-7]. Affermazioni come “virtualmente ogni conquista del secolo scorso, è dipesa direttamente o indirettamente dalla ricerca con gli animali” si trovano spesso nella letteratura per sottolineare l’importanza e la necessità dei modelli animali usati nello sviluppo di farmaci e nella scienza medica. Robert Matthews [6] ha discusso la validità di questa dichiarazione particolare in un articolo di critica nel 2008 e ha concluso che questa affermazione è aneddotica e generalmente non corrisponde al vero. Egli è convinto, però, e sicuramente vi è la prova che i “modelli animali possono e hanno fornito molti spunti cruciali che hanno portato a importanti progressi nella medicina e nella chirurgia” . Quindi, egli sostiene che le indagini sistematiche sull’uso di modelli animali e sulle prove che forse possono fornire sono necessarie.

Gill Langley, nel suo saggio critico nel 2009, riferì la stessa affermazione di Matthews dell’anno precedente [7] . Langley ha concluso che basarsi su surrogati animali di malattie umane è un approccio sbagliato nella scienza. Le sue ricerche, così come diverse revisioni sistematiche pubblicate dell’affidabilità dei modelli animali, hanno dimostrato che meno del 50% degli studi su animali hanno predetto i risultati umani sufficientemente. In alcuni settori della ricerca, ad esempio nello sviluppo di un vaccino contro la sindrome da immunodeficienza acquisita (AIDS), il fallimento di previsione dei modelli di scimpanzé e di macaco è del 100% [7, 8].

Siamo convinti che i modelli animali possono essere strumenti utili nella ricerca biomedica, ma senza dubbio, è stato spesso osservato che gli effetti trovati nei modelli animali non possono essere tradotti nel clinico.

Riferimenti:

[1] Pound P, Ebrahim S, Sandercock P, Bracken MB, Roberts I, Reviewing Animal Trials Systematically (RATS) Group Where is the evidence that animal research benefits humans? BMJ. 2004;328:514–517. doi: 10.1136/bmj.328.7438.514.
[2] Bailey J. Non-human primates in medical research and drug development: a critical review. Biogenic Amines. 2005;19:235–255. doi: 10.1163/156939105774647385. 
[3] Hackam DG, Redelmeier DA. Translation of research evidence from animals to humans. JAMA.2006;296:1731–1732. doi: 10.1001/jama.296.14.1731. 
[4] Hackam DG. Translating animal research into clinical benefit. BMJ. 2007;334:163–164. doi: 10.1136/bmj.39104.362951.80.
[5] Knight A. Systematic reviews of animal experiments demonstrate poor human clinical and toxicological utility. ALTEX. 2007;14:125–130.
[6] Matthews RAJ. Medical progress depends on animal models—doesn’t it? J R Soc Med. 2008;101:95–98. doi: 10.1258/jrsm.2007.070164.
[7] Langley G. The validity of animal experiments in medical research. RSDA. 2009;1:161–168.
[8] Buckland G. In: Replacing primates in medical research: an expert report by the Dr Hadwen Trust, FRAME and Advocates for Animals. Available from science@drhadwentrust.org.
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Approcci in vitro per valutare le proprietà ADMET dei farmaci

[Li AP. In vitro approaches to evaluate ADMET drug properties. Curr Top Med Chem. 2004;4(7):701-6.]

Abstract:

Saggi in vitro sviluppati per la valutazione delle proprietà farmacologiche possono accelerare il processo di sviluppo dei farmaci. I saggi chiave sono quelli per la valutazione della biodisponibilità, stabilità metabolica, potenziale interazione farmaco-farmaco, e tossicità. Per la biodisponibilità, il saggio Caco-2 del carcinoma del colon umano è il più utilizzato, consentendo la valutazione di molteplici vie di assorbimento intestinale compresi assorbimento paracellulare, assorbimento transcellulare, assorbimento mediato da trasportatore ed efflusso. Per la stabilità metabolica e le interazioni farmaco-farmaco, i microsomi epatici umani, gli epatociti e i microsomi espressi da cDNA sono comunemente usati, con gli epatociti umani che rappresentano il sistema più completo, che contiene tutti gli enzimi e cofattori metabolici a livello fisiologico e una membrana plasmatica intatta per consentire la modellazione delle concentrazioni intracellulari dei farmaci. Le cellule umane primarie da organi bersaglio (ad esempio, epatociti umani per epatotossicità umana) dovrebbero rappresentare il miglior sistema sperimentale per la valutazione della tossicità del farmaco umano. Questi test, se applicati in modo intelligente con i loro limiti, dovrebbe notevolmente facilitare la selezione dei farmaci candidati con un’alta probabilità di successo clinico.

[Li AP. Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery. Drug Discov Today. 2001 Apr 1;6(7):357-366.]

Full Text: http://dipbsf.uninsubria.it/monti/S&D%202009/adme-tox1.pdf

Abstract:

Non vi è dubbio che le proprietà ADME/Tox, assorbimento, distribuzione, metabolismo, eliminazione e tossicità, sono le proprietà fondamentali per il successo clinico finale di un candidato farmaco. E’ stato stimato che circa il 50% dei farmaci fallisce a causa di un’efficacia inaccettabile, che include scarsa biodisponibilità a seguito dell’inefficace assorbimento intestinale e indesiderabile stabilità metabolica [1]. E ‘stato inoltre stimato che il 40% dei candidati farmaci hanno fallito in passato a causa di problemi di sicurezza [2]. In questa recensione, le metodologie che sono disponibili per l’uso nello sviluppo di farmaci come screen in vitro basati sull’uomo per le proprietà farmacologiche ADME/Tox sono discusse.

Tossicità dei farmaci e modelli animali

[Li AP. Accurate prediction of human drug toxicity: a major challenge in drug development. Chem Biol Interact. 2004 Nov 1;150(1):3-7.]

Full Text:
http://mx1.admetgroup.com/CBI_Major_Challenge.pdf

Abstract:

“Nel corso degli ultimi decenni, un certo numero di farmaci è stato ritirato o ha richiesto un’etichettatura speciale a causa di effetti avversi osservati dopo la commercializzazione. Le differenze di specie nella tossicità dei farmaci nei test preclinici di sicurezza e la mancanza di biomarcatori sensibili e una popolazione non rappresentativa dei pazienti negli studi clinici sono le probabili ragioni dei fallimenti nel predire la tossicità umana ai farmaci. Si propone che la tossicologia dovrebbe evolvere da pratica empirica a disciplina investigativa. La previsione accurata della tossicità umana ai farmaci richiede risorse e tempo da spendere nel definire chiaramente i percorsi tossici chiave e i corrispondenti fattori di rischio, che si spera, saranno compensati dai vantaggi di una minore percentuale di fallimenti clinici dovuti alla tossicità e una frequenza ridotta di ritiro dal mercato a causa di inaccettabili effetti avversi ai farmaci.”

Nel testo:

Ragioni del fallimento nel predire la tossicità umana ai farmaci:

Una chiara comprensione dei motivi per il fallimento nel prevedere la tossicità umana ai farmaci è il primo passo per lo sviluppo di un approccio migliore. Una revisione del metodo standard per lo sviluppo di farmaci produce indizi sul motivo per cui la tossicità umana ai farmaci non è sempre prevista con precisione (tabella 3). La sicurezza dei farmaci è inizialmente valutata preclinicamente su animali da laboratorio, in genere in tre specie di animali come topo, ratto e cane. I risultati preclinici degli studi di sicurezza sono presentati alla US Food and Drug Administration (FDA) per il riconoscimento dello status di Investigative New Drug (IND) per le successive prove cliniche su soggetti umani.
Questo approccio standard sembra essere adeguato-la tossicità viene prima definita in tre specie di animali seguiti da prove umane. I farmaci con tossicità inaccettabile verso entrambi gli animali da laboratorio e gli esseri umani dovrebbero essere rilevati dagli studi preclinici di sicurezza. I farmaci con tossicità solo negli esseri umani e non in animali non umani dovrebbero essere rilevati negli studi clinici. Tuttavia, questo approccio ha diverse falle:

 

1. Gli studi condotti su animali da laboratorio non riflettono sempre la tossicità umana ai farmaci a causa delle differenze specie-specie:

a. I meccanismi tossici e disintossicanti possono essere diversi tra gli animali da laboratorio e gli esseri umani.
Un farmaco può essere non tossico per animali da laboratorio e tossico per l’uomo se, per esempio, la tossicità è dovuta a un metabolita umano-specifico, o se il meccanismo disintossicante nel ratto è assente nell’uomo. Che gli animali e gli esseri umani abbiano diversi enzimi del metabolismo dei farmaci è un fenomeno ben noto. Una differenza drammatica tra ratto e uomo nel metabolismo dei farmaci è dimostrata dal metabolismo della cumarina, un anticoagulante. Il metabolita umano, 7-idrossicumarina, non è fatto dal ratto [4].

b. La sensibilità agli effetti tossici è diversa tra gli animali da laboratorio e gli esseri umani. Le differenze di specie di tossicità possono non essere dovute a differenze nel metabolismo, ma a causa della sensibilità intrinseca delle popolazioni di cellule colpite alla sostanza tossica. Un esempio è osservato con il bizelesin, un potente derivato sintetico dell’agente antitumorale CC-1065 che preferibilmente alchila e si lega al solco minore del DNA. I risultati con cellule mielopoietiche in vitro, in assenza di metabolismo epatico, riproducevano le differenze di specie nella mielosoppressione osservate in vivo, dimostrando che le cellule murine sono 1000 volte più sensibili delle cellule umane e canine [5]. I risultati di questo studio in vitro suggeriscono che, oltre a differenze di specie nel metabolismo dei farmaci, le differenze di sensibilità delle cellule bersaglio tra le specie possono anche rappresentare differenze di specie nella tossicità.

 

2. L’ipotesi che tutti i farmaci che sono tossici per gli esseri umani verrebbero rilevati negli studi clinici non può essere vera per i seguenti motivi:

a. Limitazioni con gli endpoint di tossicità. A differenza degli animali da laboratorio in cui si possono sacrificare gli animali ed esaminare i tessuti, per ragioni etiche, nei trial clinici umani si possono usare solo endpoint relativamente non invasivi per la valutazione della tossicità. Tali endpoint includono chiari segni di tossicità e di chimica clinica dei fluidi corporei che danno solo informazioni che riflettono grave tossicità acuta.

b. Limitazione del numero di individui in un studio. Il numero di pazienti coinvolti in studi clinici è significativamente più piccolo dei milioni di pazienti a cui può essere somministrato un nuovo farmaco. Gli eventi che si verificano in frequenze rare (ad esempio, la tossicità dei farmaci idiosincratica che si verifica in meno di 1 paziente su 5000 [6]) non sarebbero individuati nelle fasi I, II e III dei test clinici, ma saranno presentati dopo che il farmaco commercializzato verrà somministrato ad una grande popolazione di pazienti.

c. Mancanza di rappresentazione della vera popolazione dei pazienti. La popolazione dei pazienti a cui viene somministrato il farmaco dopo la commercializzazione può contenere individui che non possono essere rappresentati negli studi clinici. Alcune condizioni ambientali (ad esempio, i farmaci e gli alimenti co-somministrati) sono estremamente difficili da modellare negli studi clinici. Variazioni genetiche rare, fattori genetici soprattutto non ancora scoperti, possono aumentare la tossicità dei farmaci, non sono in grado di essere rappresentati negli studi clinici.

d. Alterazioni della formulazione dopo l’approvazione. Nuove formulazioni prodotte e commercializzate dopo l’approvazione iniziale possono avere un dosaggio diverso o maggiore biodisponibilità, in tal modo possono portare a reazioni avverse inattese. Questo, tuttavia, è un fattore che può essere corretto tramite vigilanza nell’etichettatura e nell’utilizzo del farmaco.

Sistema funzionale per screening ad alto contenuto di giunzioni neuromuscolari in vitro

[A.S.T. Smith, C.J. Long, K. Pirozzi, J.J. Hickman. A functional system for high-content screening of neuromuscular junctions in vitro. TECHNOLOGY 0 0:0, 1-12]

Abstract:

“I sistemi di screening ad alto contenuto fenotipico sono la logica estensione degli attuali efficienti, ma a basso contenuto informativo, screen preclinici per la scoperta di farmaci. Uno screening fisiologicamente accurato in vitro di giunzione neuromuscolare (NMJ) sarebbe quindi di enorme beneficio per lo studio delle neuropatie periferiche, nonché per la ricerca neuromuscolare di base e applicata. Ad oggi, nessun sistema di analisi selettiva completamente definito è stato sviluppato che consentirebbe ai ricercatori di determinare l’uscita funzionale delle fibre muscolari coltivate (miotubi) quando stimolati tramite il NMJ in tempo reale per applicazioni sia acute che croniche. Presentiamo qui lo sviluppo di tale modello di screening fenotipico, con evidenza di formazione di NMJ e trasmissione neuromuscolare iniziata di motoneuroni in un sistema automatizzato. I miotubi assemblati su cantilever di silicone hanno permesso la misurazione della deflessione del substrato in risposta alla contrazione e hanno fornito le basi per monitorare l’effetto della stimolazione dei motoneuroni controllati sul comportamento contrattile. L’effetto è stato bloccato mediante trattamento con D-tubocurarina, confermando la funzionalità di giunzione neuromuscolare in questo sistema di saggio altamente multiplex.”

Da “Animal testing could be reduced with new research – Technology created to mimic standard human muscular functions”:

“Una tecnologia di questa natura permetterà ai ricercatori non solo di eliminare gli animali dai loro test, ma consentirà anche alle aziende farmaceutiche di essere in grado di produrre trattamenti più rapidi e precisi” dice il Prof. James Hickman

[…] “Il problema è che quando si ottimizza un trattamento per l’animale, semplicemente non si traduce per l’uomo, perché gli effetti secondari non sono presi in considerazione”, ha detto Hickman. “Se possiamo effettivamente creare un sistema umano che può prevedere i più piccoli effetti, speriamo di poter ottenere qualcosa di più efficace che arrivi agli studi clinici”.

Le persone che hanno la malattia di Lou Gehrig, atrofia muscolare spinale, lesioni del midollo spinale e neuropatie base sono alcuni dei molti pazienti che potrebbero beneficiare di una svolta di questo tipo, Hickman ha detto.

“Abbiamo curato più di 200 malattie in ratti e topi (i cui risultati) non si sono tradotti per l’uomo perché la nostra fisiologia è diversa…”

Hickman ha iniziato a scrivere su questo argomento nel 1993, e (solo) nel 2002 gli è stato conferito il finanziamento per la prima volta. Oggi, questa tecnologia esiste grazie, in parte, ad una concessione $ 10 milioni da National Institutes of Health che è stata assegnata sia all’UCF che alla Cornell University per la ricerca della riproduzione delle funzioni umane in modo che gli animali possano essere sostituiti negli studi pre-clinici.

Metabolomica “on-a-chip”, sistemi predittivi in tossicologia e organi bioartificiali

[Shintu L, Baudoin R, Navratil V, Prot JM, Pontoizeau C, Defernez M, Blaise BJ, Domange C, Péry AR, Toulhoat P, Legallais C, Brochot C, Leclerc E, Dumas ME. Metabolomics-on-a-chip and predictive systems toxicology in microfluidic bioartificial organs. Anal Chem. 2012 Feb 21;84(4):1840-8. doi: 10.1021/ac2011075. Epub 2012 Feb 8.]

Abstract Image

Abstract:

Il mondo deve affrontare sfide complesse per la valutazione del rischio di sostanze chimiche. Gli organi bioartificiali consentono il controllo spaziale e temporale della crescita cellulare e biochimica, critica per funzioni metaboliche organo-specifiche e particolarmente rilevante per testare le risposte metaboliche a dosi associate sia alla tossicità farmaceutica che ambientale. Qui presentiamo un metodo che combina un sistema di microfluidica con footprint basato sulla metabolomica di (1)H NMR, come approccio ad alta produttività di screening di piccole molecole. Abbiamo caratterizzato la tossicità di diverse molecole: ammoniaca (NH(3)), un inquinante ambientale che porta ad acidosi metabolica e tossicità epatica e renale; dimetilsolfossido (DMSO), un solvente che interagisce con i radicali liberi; e N- acetil-para-ammino-(APAP o paracetamolo), un farmaco analgesico epatotossico. Riportiamo le risposte metaboliche dose-dipendenti organo-specifiche di NH (3) in diversi organi bioartificiali (fegato, rene, e co-colture), così come la predittività (99 % di accuratezza per NH(3) e 94 % per APAP) per composti specifici. La nostra integrazione di microtecnologie, coltura cellulare in biochip microfluidici, e profili metabolici apre allo sviluppo dei cosiddetti saggi “metabolomica-on-a-chip” in tossicologia farmaceutica e ambientale.

Neurotossicità per lo sviluppo e metodi alternativi

[Moors, M., Rockel, T. D., Abel, J., Cline, J. E., Gassmann, K., Schreiber, T., Schuwald, J., Weinmann, N., Fritsche, E. (2009). Human neurospheres as three-dimensional cellular systems for developmental neurotoxicity testing. Environ. Health Perspect. 117:1131-1138.]

Full Text: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2717141/

Abstract:

Background:
La neurotossicità per lo sviluppo (DNT) di sostanze chimiche ambientali è una grave minaccia per la salute umana. Le linee guida di test DNT attuali propongono ricerche nei roditori, che richiedono un gran numero di animali. Per quanto riguarda le “3 R” (riduzione, sostituzione e raffinamento) della sperimentazione animale e la regolamentazione europea delle sostanze chimiche [Registrazione, valutazione e autorizzazione delle sostanze chimiche (REACH)], sono necessarie strategie di sperimentazione alternative al fine di raffinare e ridurre gli esperimenti su animali e consentire screening più veloci e meno costosi.

Obiettivi:
L’obiettivo di questo studio è stato quello di stabilire un sistema di test tridimensionale per lo screening di DNT basato su cellule cerebrali fetali umane.

Metodi
Abbiamo stabilito saggi adatti per la rilevazione di disturbi nei processi fondamentali dello sviluppo del cervello utilizzando cellule umane progenitrici neurali (hNPCs), che crescono come neurosfere. Inoltre, abbiamo valutato gli effetti del mercurio e dello stress ossidativo su queste cellule.

Risultati:
Abbiamo scoperto che le neurosfere umane imitano la proliferazione, la differenziazione e la migrazione in vitro. L’esposizione all’agente staurosporina proapoptotica suggerisce inoltre che le neurosfere umane possiedono macchinari funzionanti di apoptosi. I neurotossici per lo sviluppo cloruro di metilmercurio e cloruro di mercurio hanno diminuito la distanza di migrazione e il numero di cellule simil-neuronali nelle hNPCs differenziate. Inoltre, le hNPCs vanno incontro ad apoptosi caspasi-indipendente se esposte verso elevate quantità di stress ossidativo.

Conclusioni:
Le neurosfere umane sono probabilmente in grado di imitare i processi fondamentali dello sviluppo del cervello, e questi processi possono essere modulati da sostanze neurotossiche per lo sviluppo. Così, questo sistema di cellule tridimensionale è un metodo promettente per la sperimentazione di DNT.

Figure 1

Schizofrenia “in a dish”

[Ewen Callaway. Schizophrenia ‘in a dish’. Published online 13 April 2011 | Nature | doi:10.1038/news.2011.232 – http://www.nature.com/news/2011/110413/full/news.2011.232.html]

Nel testo:

I ricercatori stanno facendo incursioni nella sfida di modellare la malattia mentale, grazie alle cellule dei pazienti.

Prima di suicidarsi, all’età di 22 anni, un anonimo uomo con schizofrenia ha donato una biopsia delle sue cellule della pelle alla ricerca. Rinate come neuroni, queste cellule possono aiutare i neuroscienziati a distruggere la malattia con cui ha lottato con fin dalla prima infanzia.

Gli esperimenti su queste cellule, così come quelle di alcuni pazienti, sono riportati oggi su Nature [1]. Rappresentano il primo di quello che sono sicuro sia molte malattie mentali “in un piatto” [“in a dish” n.d.T.], realizzato riprogrammando le cellule della pelle dei pazienti ad uno stato embrionale da cui si possono formare qualsiasi tipo di tessuto.

[ … ]

Fred Gage, neuroscienziato presso il Salk Institute for Biological Studies di San Diego, in California, e il suo team hanno creato modelli iPSC dalle cellule dell’uomo 22enne di cui sopra, così come quelli di due coppie fratello-sorella, tutti i quali avevano la schizofrenia o le condizioni correlate come disturbo schizoaffettivo.

Quando gli autori hanno trasformato le iPSCs in neuroni, hanno notato che le cellule derivate dal paziente effettuavano un minor numero di connessioni, o sinapsi, con altri neuroni nello stesso piatto rispetto a quelle che hanno fatto i neuroni da persone senza disturbi psichiatrici. Tuttavia, i test hanno mostrato che i neuroni dei pazienti conducevano impulsi elettrici altrettanto bene come facevano i neuroni normali .

È interessante notare che il farmaco antipsicotico loxapina, utilizzato nel trattamento della schizofrenia, potenziava il numero di sinapsi formate dai neuroni derivati dal paziente a livelli normali.

Quattro altri farmaci antipsicotici non avevano alcun effetto consistente, anche se Gage rileva che tutti i farmaci creavano beneficio alle cellule provenienti da almeno un paziente. Il suo team ha anche riferito differenze di espressione genica tra i neuroni di pazienti con schizofrenia e quelli di persone sane, compresi i cambiamenti di geni legati alla funzione delle sinapsi e altri precedentemente coinvolti in studi di genetica della malattia.

[ … ]

Stephen Haggarty , un neurobiologo chimico presso il Massachusetts General Hospital di Boston, sta affrontando la complessità genetica della malattia mentale a testa alta. Il suo team sta creando neuroni da pazienti con mutazioni specifiche implicate nella schizofrenia, nel disturbo bipolare e in altre condizioni. Gli scienziati non sanno quello che la maggior parte delle mutazioni legate alla schizofrenia fanno a una cella, e i modelli iPSC offrono un modo per scoprirlo, dice Haggarty.

Nonostante queste sfide, i modelli iPSC di malattia mentale possono essere la migliore speranza per identificare i difetti fondamentali che stanno alla base di queste malattie – i e modi per invertirle. La maggior parte dei farmaci antipsicotici mira lo stesso recettore della dopamina, e i modelli iPSC potrebbero essere “un modo per trovare nuovi trattamenti che non sono sempre lo stesso”, dice Margolis.

neurons

Referenze:

[1] Kristen J. Brennand, Anthony Simone, Jessica Jou, Chelsea Gelboin-Burkhart, Ngoc Tran, Sarah Sangar, Yan Li, Yangling Mu, Gong Chen, Diana Yu, Shane McCarthy, Jonathan Sebat & Fred H. Gage. Modelling schizophrenia using human induced pluripotent stem cells. Nature 473, 221–225 (12 May 2011) doi:10.1038/nature09915