In Difesa della Sperimentazione… Arcaica!

Oggi ci occuperemo di rispondere all’articolo “La Lega Anti Verità” del blog “In Difesa della Sperimentazione Animale”. Chiediamo scusa per il titolo, ma a ironia rispondiamo ironia.

Partiamo subito sull’argomento “Direttiva Europea”. I pro-SA affermano:

“La normativa impone l’anestesia per ogni test che sia più invasivo della puntura stessa.”

In realtà la direttiva stessa ci dice, all’articolo 14, comma 1, che l’anestesia si effettua “salvo non sia opportuno”, e, al comma 2, che non si effettua “se l’anestesia è incompatibile con lo scopo della procedura“.

Ad esempio, dunque, se l’anestesia interferisse con la sostanza da testare, sarebbe certamente saltata, in quanto “incompatibile con lo scopo della procedura”.

Passiamo oltre. I pro-SA continuano, su altro tema:

“Non so se avete fatto caso, ma la Kuan prima sostiene che si sperimenta già sugli umani e poi afferma che il 51% dei farmaci viene ritirato dal commercio per gravi reazioni avverse. Sapete cosa significa? Significa che persino la sperimentazione umana è inutile, e che i farmaci sono pericolosi”

Certamente la fase clinica è limitata, ma la SA ha ancora più limitazioni, se infatti contiamo che la differenza genetica tra uomo e uomo è dello 0,1% e non riusciamo a prevedere tutto, cosa dovremmo ottenere da animali che differiscono da noi per il 2, il 10 o il 15%?

“Di nuovo la Kuan fa leva sull’emotività, scaricandoci una caterva di sciocchezze ad alto tasso emotivo: “testato su umani, tra i quali bambini, volontari sani, persone del Sud del Mondo, involontari nelle corsie ospedaliere…”.
Secondo il codice di Norimberga, formulato dopo il processo ai medici nazisti che hanno sperimentato sui deportati nei lager, vige l’obbligo del consenso informato e, integrato dalla Dichiarazione di Helsinki del 1964, stabilisce in particolare il principio per il quale nessuna sperimentazione sull’uomo può essere condotta senza il permesso di chi vi si sottopone.”

In primis, conosciamo lo stato emotivo di chi si offre come soggetto sperimentale e possiamo con certezza assicurarci che non interferisca con la sua decisione?

In secondo luogo, le rassicurazioni che i farmaci siano sicuri in quanto “testati su animali”, verso un estraneo alla materia, che non conosce le problematiche di predittività del modello animale, non possono forse interferire con la sua scelta?

Infine, rimando a questo report della BBC in cui si esplica come nei paesi del Sud del mondo, tra cui l’India, le persone diventino facilmente e senza accorgersene cavie umane, cito alcune parti:
“Drug companies are facing mounting pressure to investigate reports that new medicines are being tested on some of the poorest people in India without their knowledge.”

“The family says that they had no idea that the drug Naresh was given was a trial one, and that the hospital forms which they signed had been written in English “so we couldn’t understand anything”.

L’articolo ci fa notare come quest’irregolarità sia pressoché la prassi.

Comunque, andiamo avanti:

“Se un farmaco non si è rivelato dannoso in fase clinica ( sperimentazione su volontari sani e malati) o in farmacovigilanza (controllo durante il commercio), questa problema non poteva essere predetto in alcun modo.”

In realtà sarebbe potuto essere predetto migliorando la fase preclinica, attraverso l’implementazione di nuove metodologie, evitando che finisse in fase clinica, e orientandoci verso la medicina personalizzata e la farmacogenomica.

Tra l’altro, la fase preclinica è l’unica migliorabile sostanzialmente, come si può agire per migliorare la predittività della fase clinica? Non possiamo manipolare il DNA delle persone, e d’altra parte pur se potessimo farlo, è essenziale prevenire i danni piuttosto che scoprirli nei test sull’uomo, considerando che i volontari umani sono persone comunque da proteggere.

“Se è risultato efficace sugli uomini prima di essere commercializzato e dopo la commercializzazione invece no, dare la colpa esclusivamente alla sperimentazione animale è alquanto sciocco visto che l’iter di sperimentazione farmaceutica è composto da diverse fasi.”

Come detto prima, se la fase clinica è limitata, non lo sarà forse ancora di più la SA, considerando che le differenze tra uomo e animale sono infinitamente superiori a quelle tra uomo e uomo?
Inoltre, ai fallimenti che si hanno dal passaggio dalla sperimentazione animale alla fase clinica I, si devono aggiungere quelli che si hanno nei trial clinici stessi e dopo la commercializzazione, per avere una visione globale di quanto la SA sia – alla fine dei conti – effettivamente efficace e di quali siano i suoi limiti.

“La sperimentazione animale nella branca della tossicologia, in particolare nell’iter della sperimentazione di un farmaco, serve principalmente a raccogliere dati utili e per la sicurezza delle cavie umane in fase clinica. Per cui “sicurezza del farmaco in assoluto” non è il motivo principale per cui si impiega la sperimentazione animale.”

In realtà, van Meer e colleghi [1] ci spiegano come agli animali vengano somministrate dosi elevate e per lunghi periodi, proprio allo scopo di far emergere anche i potenziali effetti collaterali rari, quelli che potrebbero verificarsi proprio nei farmaci commercializzati. Riportiamo a tal proposito le parole degli autori, che ci fanno capire come nell’establishment tali studi siano considerati in grado di stabilire tali effetti avversi (nonostante i risultati che danno dimostrino l’opposto):

“One could argue that non-clinical studies are not designed to identify rare adverse reactions that appear after market approval.
Although the number of animals used in non-clinical studies is relatively small, the studies are designed to find important side effects that are likely to occur in humans (International Conference on Harmonisation of Technical Requirements for Registration of Pharmaceuticals for Human Use, 2009). However, as high doses are administered for a prolonged period to elicit a complete toxicological response in animals, this approach can also estimate potential toxicities that could occur in humans.”

Dunque ci chiediamo, se non servono a rilevare questi effetti avversi, perchè farli? E se dovrebbero farlo, perchè non considerarli fallimentari quando non riescono?

Ricordiamo infatti che gli stessi autori ci dicono che gli animali non prevedono l’81% dei gravi effetti avversi dei farmaci commercializzati, se questo non è un fallimento… cos’è?

I pro-SA a questo punto, passano alle scoperte effettuate grazie ai modelli animali:

“Vogliamo forse scordarci come è stata scoperta l’Insulina, oppure come è stata curata la Polio? Vogliamo forse dimenticarci degli studi di Andrew Huxley sui calamari e la scoperta del potenziale d’azione dei neuroni? Vogliamo dimenticarci della scoperta dell’energia elettrica grazie agli studi di Galvani sulle rane?”

Questa è pura aneddotica, un modello, qualunque esso sia, non può essere valutato in base a singoli episodi, ma vanno presi in considerazione i veri positivi, i veri negativi, i falsi positivi, i falsi negativi, e da essi ricavati i valori di sensibilità, specificità, valore predittivo positivo (
VPP) e valore predittivo negativo (VPN).

Per chiarirci:
Sensibilità = Veri positivi/(Veri positivi + Falsi negativi)
Specificità = Veri negativi/(Veri negativi + Falsi positivi)
VPP = Veri Positivi/(Veri Positivi + Falsi Positivi)
VPN = Veri Negativi/(Veri Negativi + Falsi Negativi)

Quando saranno portati questi valori, allora si potrà dire che non si sta parlando del nulla.

“L’articolo dice che nel 51% dei farmaci dopo il commercio vengono scoperti effetti collaterali anche gravi, non che vengono ritirati”

L’articolo non parla di effetti collaterali “anche” gravi, parla di effetti collaterali solo gravi.

“se fossero ritirati vuol dire che l’incidenza di problemi conseguiti all’assunzione dei farmaci è stata significativa.”

In primis la frase è grammaticalmente errata, in secondo luogo il ritiro dei farmaci è basato su valutazioni arbitrarie sul rapporto rischi-benefici del farmaco stesso, è dunque più opportuno rifarsi agli effetti avversi gravi, nel valutare la capacità di una metodologia di rilevare rischi per la salute umana.

“Se studio un farmaco su un campione di 1000 individui molto probabilmente non vedrò mai quegli effetti collaterali rarissimi, quelli che si verificano 1 volta su 30mila, semplicemente perché il campione non è abbastanza ampio, ma come non potremmo condurre studi su campioni così grandi? E’ praticamente impossibile, è per questo che esiste la farmacovigilanza: dopo che vengono immessi sul mercato i farmaci sono posti sempre sotto controllo.”

Ripeto, proprio per questo motivo agli animali vengano somministrate dosi elevate e per lunghi periodi. Non è questo il loro scopo? Allora perchè non si saltano? Se lo è, allora perchè non sarebbe un fallimento? E’ sempre la stessa questione.

“sappiamo bene che gli animali sono diversi dall’uomo, non c’è diretta sovrapposizione, ma al di là delle differenze bisogna osservare le somiglianze: il sistema nervoso, il circolo sanguigno, il sistema endocrino….”

Questa è una semplificazione dell’argomento relativo ai processi conservati tra le specie durante l’evoluzione, i cosiddetti caratteri conservativi. Tuttavia, il concetto di processo conservativo deve essere esaminato nel contesto che gli animali umani e non-umani sono sistemi evoluti, complessi e adattivi. Gli animali (uomo compreso) sono infatti tipici esempi di sistemi complessi a molti livelli, dotati di proprietà emergenti, modulari e non lineari, e dato che gli animali non-umani sono esempi di sistemi viventi che sono differentemente complessi dagli umani, una perturbazione nel sistema complesso S1 che provoca un effetto A, non necessariamente porterà allo stesso effetto A nel sistema complesso S2, a prescindere da quanto “simili” possano essere i sistemi S1 ed S2.
Difatti, mentre nello studio dei processi biochimici di base non c’è bisogno di “scomodare” l’organismo intero nella sua complessità in quanto l’esame del processo conservato avviene allo stesso livello di organizzazione o nello stesso modulo ed è soggetto di studio del riduzionismo, l’uso del modello animale quale modello causale analogo (CAM), ovvero come modello predittivo per l’Uomo nello studio di patologie umane complesse, reazione a farmaci e vaccini, dispositivi, xenobiotici, ecc, implica spesso che il tratto o la risposta in fase di studio sia situato a livelli più alti di organizzazione, si trovi in un modulo diverso, o sia influenzato da altri moduli e dunque la mera presenza di processi conservati tra le specie diviene insufficiente per l’estrapolazione dei dati all’Uomo [2].

“Se pensiamo alle ultime scoperte della genomica, nella sostanza il materiale non è diverso, per fare un esempio nel topo più del 90% delle proteine sono simili a quelle umane!”

In realtà la somiglianza genetica ci dice ben poco, infatti, nonostante abbiamo in comune il 98-99% del nostro DNA con lo scimpanzè (la specie geneticamente più vicina a noi), questa differenza dell’1-2% diventa un 80% di discordanza nel passaggio da geni a proteine [3].

Altre differenze a livello genetico con gli animali possono riguardare [4]:

• la presenza (o assenza) di certi geni.
• la presenza (o assenza) di certi alleli.
• il background genetico e i geni modificatori che agiscono sui geni influenzati dai farmaci o dalla malattia.
• la regolazione e l’espressione dei geni.
• le reti di geni.
• lo splicing alternativo, che permette a un gene di formare o di contribuire a formare molte proteine diverse.
• le interazioni tra proteine.
• le interazioni tra geni e proteine.
• l’evoluzione di vecchi geni che li porta a svolgere nuove funzioni.
• il trasferimento genico orizzontale (TGO). Il TGO avviene quando i geni di un organismo vengono incorporati in un altro organismo senza che l’organismo ricevente discenda da quello donatore. Per esempio, la resistenza agli antibiotici può avvenire mediante TGO.
• le caratteristiche epigenetiche. L’epigenetica è il settore relativamente nuovo che studia i cambiamenti dell’espressione genica che possono essere ereditati e che avvengono senza modifiche della sequenza di DNA coinvolta. Per esempio, a causa di influenze ambientali, un gene regolatore può essere modificato in modo tale da attivarsi o disattivarsi permettendo a una malattia di manifestarsi.
• la presenza di mutazioni geniche e cromosomiche come i polimorfismi del singolo nucleotide, le varianti del numero di copie, le duplicazioni, le inversioni, le delezioni e le inserzioni.
• la possibile perdita o acquisizione di determinati geni durante l’evoluzione.
• l’alterazione di geni o cromosomi.
• le differenze rispetto alle forme di uno stesso gene.
• la presenza di pseudogeni (geni che hanno perso la loro funzione nel corso dell’evoluzione).
• la diversità di geni per svolgere la stessa funzione.
• le differenze nelle reti di regolazione genica.
• i miRNA.

“Non esiste modello predittivo al 100%, sovrapponibile completamente all’uomo, non avrebbe proprio senso parlare di “modello” in tal caso. Per dire la verità non esiste neanche un solo uomo che sia veramente rappresentativo di tutta la popolazione umana, siamo tutti diversi.”

In realtà proprio per la differenza tra uomo e uomo ci si sta sempre più orientando verso la medicina personalizzata e farmacogenomica, andare verso un modello ancora più lontano da noi (l’animale) significa invece allontanarci sempre di più da questo obiettivo.

Per quanto riguarda i metodi alternativi, sapevate che il modello animale è il validante per tutti gli altri modelli?
Validare vuol dire confrontare i risultati e la sperimentazione animale viene impiegata come metro di confronto. Il metodo alternativo per essere un sostituto efficace dovrà dare risultati almeno pari a quello che voglio sostituire, ovvero alla sperimentazione animale.

Infatti è per questo che critichiamo anche il metodo di validazione che si basa sull’animale, considerate di questo modello.
Un esempio può mostrare al meglio l’attuale situazione: nella sostituzione del Draize Test, vi è stata la necessità di effettuare una seconda validazione, non per colpa dei metodi sostitutivi, ma per i falsi positivi che il Draize test tendeva a dare [5].
Infatti il Cytosensor Microphysiometer, che doveva rimpiazzare il Draize Test, diede un risultato inizialmente inconcludente, dato che si confrontò il suo risultato con quello del Draize test stesso, finchè non fu validato grazie a meta-analisi retrospettive [6].
Ciò dimostra inequivocabilmente che comparare i dati di un metodo alternativo con quelli di un modello che non rappre
senta al meglio l’Uomo, come l’animale, può darci risultati fuorvianti sulle potenzialità della metodologia che si sta valutando.
Pertanto, ci auguriamo: in primis che l’attuale iter di validazione venga sostituito completamente dalla validazione attraverso meta-analisi retrospettive derivanti da dati conosciuti sull’Uomo, in secondo luogo che i tempi di validazione vengano accelerati, e infine che venga data maggiore attenzione ai metodi che non utilizzano derivati animali e ai potenziali replacement, al fine di ottenere nel minor tempo possibile metodologie più sicure per la tutela della salute umana.

“A tal proposito consigliamo la lettura di questo articolo dove sono state intervistate proprio le persone che si occupano di validare i metodi alternativi! (link)”

Come già detto, questa analisi si riferisce ai metodi alternativi attualmente validati o in fase di validazione, non agli innumerevoli dimostratisi validi, ma non ancora approvati dall’ECVAM in quanto gli autori non potevano sostenere i costi relativi alla procedura di validazione, in quanto il procedimento di validazione è molto lento e in quanto sussistono problemi procedurali (descritti sopra) relativi alla validazione stessa.
Per le altre metodologie, è necessario valutarle basandoci sui dati provenienti dalla letteratura scientifica. Per capire infatti che esistono molti altri metodi con ampie potenzialità e non ancora obbligatori, basta fare una breve ricerca bibliografica su Pubmed e vedere di persona che non tutte le tecniche in vitro, in silico, che sfruttano la microfluidica, l’organomica, la genomica, ecc. si utilizzano per legge e che le metodologie approvate dall’ECVAM non rappresentano la totalità delle alternative

“Tornando al discorso delle differenze genetiche tra le varie specie, con il progresso tecnologico la differenza biologica non rappresenta più un grosso problema, grazie anche all’ingegneria genetica, che porta alla creazione di cavie transgeniche, oramai costruite ad hoc per studiare i meccanismi biologici in modo che simulino al meglio quelli umani!”

In realtà anche i modelli geneticamente modificati hanno le loro limitazioni, infatti Bhogal e Combes affermano:
“[…] even if the desired GA mice are created, they are not always good models of human disease, for several fundamental reasons. These include the fact that humans are about 3000 times larger than mice; they possess a much greater number of cells, some of which have to communicate over long distances; and the lifespans of mice and humans are vastly different. Moreover, there is a lower likelihood that errors within the mouse genome will eventually result in chronic diseases such as cancer, due to the greatly reduced number of cell divisions that occur in the body of this species over its lifetime, as compared with humans.
[…] a single nucleotide difference can dramatically alter the function of the protein expressed. Such subtle changes can have important phenotypic consequences for a species, affecting physical characteristics, as well as biochemistry, physiology and pharmacology, leading via variations in temporal and spatial protein expression to species-specific metabolism, immune responses, sensory perception and endocrine functions.
Therefore, assumptions about the functional equivalence of homologous genes in mice and humans can be erroneous.

[…] GA mouse models of human disease often lack relevance in the case of complex multigenic disorders.
Indeed, some studies in GA mice have been less informative than the corresponding investigations with less-complex organisms and cell culture systems.
This is particularly true for mouse models developed by using forward genetics, where an undefined number of mutations may have contributed to an overall phenotype which resembles a human disorder, but which may share few, if any, of the underlying biochemical or genetic causes of the respective human disorders. The relevance of many transgenic mouse models can be questioned on the basis that, even if a species gene homologue has the same function and expression patterns and levels in humans and mice, all the remaining components of the biochemical pathway must be equally represented in the surrogate animal, if relevant mouse models of human diseases are to be created within a laboratory setting.

[…] It should be recognised that the generation of GA mice has often confused, rather than improved, our understanding of the genetic basis of human diseases.The large numbers of only partly-relevant models available for many diseases have complicated the meaningful extrapolation of the information they provide to human medicine.” [7]

E Lynch scrive, sempre in proposito:

“L’annotazione delle funzioni geniche basata esclusivamente su fenotipi mutanti in modelli animali, così come le assunzioni di funzioni conservate tra le specie, possono essere fuorvianti. Forse ancora più importante, i modelli animali di malattie umane non possono fornire informazioni adeguate sulla funzione del gene, in particolare per i geni e i sistemi a rapida evoluzione. E’ di vitale importanza dimostrare l’equivalenza tra il gene del modello e il gene umano rispetto alla funzione particolare studiata al fine di evitare conclusioni spurie. […] Tuttavia, l’ipotesi che le funzioni geniche e i sistemi genetici siano conservati tra i modelli e gli esseri umani è data per scontata, spesso a dispetto di prove che le funzioni e le reti geniche divergono nel corso dell’evoluzione. In questa recensione, discuto alcuni meccanismi che generano divergenza funzionale e metto in evidenza esempi recenti che dimostrano che le funzioni geniche e le reti di regolazione divergono nel tempo. Questi esempi suggeriscono che l’annotazione di funzioni geniche basate esclusivamente su fenotipi mutanti nei modelli animali, così come le assunzioni di funzioni conservate tra le specie, possono essere sbagliate. Pertanto, i modelli animali di funzioni geniche e di malattie umanenon possono fornire informazioni adeguate, in particolare per la rapida evoluzione di geni e sistemi.” [8]

Note:

1. [van Meer PJ, Kooijman M, Gispen-de Wied CC, Moors EH, Schellekens H. The ability of animal studies to detect serious post marketing adverse events is limited. Regul Toxicol Pharmacol. 2012 Dec;64(3):345-9. doi: 10.1016/j.yrtph.2012.09.002. Epub 2012 Sep 12.]

2. [Greek R, Rice MJ. Animal models and conserved processes. Theor Biol Med Model. 2012 Sep 10;9:40.]

3. [Glazko G, Veeramachaneni V, Nei M, Makałowski W. Eighty percent of proteins are different between humans and chimpanzees. Gene. 2005 Feb 14;346:215-9.]

4. [Greek R, Pippus A, Hansen LA. The Nuremberg Code subverts human health and safety by requiring animal modeling. BMC Med Ethics. 2012 Jul 8;13:16. doi: 10.1186/1472-6939-13-16.]

5. [Goldberg AM, Hartung T. Protecting more than animals. Sci Am. 2006 Jan;294(1):84-91.]

6. [Hartung T, Bruner L, Curren R, Eskes C, Goldberg A, McNamee P, Scott L, Zuang V. First alternative method validated by a retrospective weight-of-evidence approach to replace the Draize eye test for the identification of non-irritant substances for a defined applicability domain. ALTEX. 2010;27(1):43-51.]

7. [Bhogal N, Combes R. The relevance of genetically altered mouse models of human disease. Altern Lab Anim. 2006 Aug;34(4):429-54.]

8. [Lynch VJ. Use with caution: developmental systems divergence and potential pitfalls of animal models. Yale J Biol Med. 2009 Jun;82(2):53-66.]